其包括：基于比對結(jié)果，識別出HPV核酸 序列上的突變位點。突變位點的識別檢測軟件可利用但不限于SOAPsnp、SOAPcnV、Varscan 和GATK。在本發(fā)明的一個實施例中，基于比對結(jié)果，將這些突變位點的突變頻率等信息加入 到組裝出的HPV全基因組序列，使得組裝出的HPV全基因組序列帶有突變位點信息。這樣， 豐富了 HPV基因組信息，利于以后更完善準確的HPV病毒的鑒定及分型檢測，也利于對型間 病毒變異體的更準確檢測，有助于輔助預(yù)期判斷宮頸癌患者病情發(fā)展和輔助指導臨床采取 的治療策略。
[0036] 為了使本發(fā)明技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的一 組引物及其在擴增HPV全基因、獲得HPV全基因組序列、檢測HPV全基因組中的用途進行詳 細的描述。應(yīng)當理解，下面示例用于解釋本發(fā)明，不是對本發(fā)明的限制。需要說明的是在本 文中所使用的術(shù)語"第一"、"第二"等僅為方便描述，不能理解為指示或暗示相對重要性，也 不能理解為之間有先后順序關(guān)系。在本發(fā)明的描述中，除非另有說明，"多個"的含義是兩個 或兩個以上。
[0037] 除另有交待，以下實施例中涉及的未特別交待的試劑、序列（接頭、標簽和測序引 物）、軟件及儀器，都是常規(guī)市售產(chǎn)品或者開源的，例如購買Illumina的測序文庫構(gòu)建試劑 盒。
[0038] 一般包括：
[0039] A)使用商業(yè)試劑盒QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, German)從生物樣品中提取HPV 病毒核酸。
[0040] B)使用表1中的特異性引物從步驟A)所得核酸中擴增HPV全基因組片段。
[0041] C)將步驟B)所得產(chǎn)物進行純化后，進行混合，并片段化為200bp左右片段。
[0042] D)使用文庫構(gòu)建試劑盒，例如包括利用T4DNA polymerase, T4Phosphonucleotide kinase 及 Klenow fragment of Escherichia coli DNA polymerase 來補齊 5'粘性末端 及去除Y粘性末端；使用d-ATP及Klenow3^ -5' Exo-enzyme對補齊產(chǎn)物進行末端加 A ; 使用包含定制編碼序列（8bp)通過高保真酶PCR擴增加到產(chǎn)物末端作為產(chǎn)物的特殊標簽， 每個特殊的標簽作為一個高通量測序庫，標簽、標簽引物可利用CN102409049A披露的；隨 后使用標準Miseq測序流程進行測序，每個循環(huán)能產(chǎn)生對應(yīng)長度序列及8bp index序列。
[0043] E)將高通量檢測原始結(jié)果經(jīng)過過濾到無用序列以及質(zhì)量較差序列，將合格序列數(shù) 據(jù)與HPV參考序列進行對比，判斷出HPV分型結(jié)果，并得出樣本中所感染的HPV各型別基因 組序列。
[0044] 本方法利用高通量檢測及長PCR(Long-PCR)技術(shù)，對生物樣本中的HPV進行檢測、 測序和/或分型。能夠用于各生物樣本中高危性HPV感染所導致的各種疾病的發(fā)生發(fā)展以 及對其進行預(yù)后指導或者輔助檢測。同時本發(fā)明還能為各種科學研宄積累更多的數(shù)據(jù)，為 進一步確定HPV病毒致病機理提供技術(shù)手段。本發(fā)明通量高、檢測時間短，成本低，其檢測 的特異性及靈敏度高，是HPV檢測及研宄的可靠的方法。
[0045] 實施例一
[0046] 使用商業(yè)試劑盒QIAamp DNAMini Kit (Qiagen, German)提取樣本核酸。
[0047] 1.將來自醫(yī)院的宮頸脫落細胞樣本（液基，宮頸取樣刷取樣）加入到2ml離心管 中，ThinPrcp?保存液保存，HOOOrmp離心5min，棄上清液，加入400 μ L PBS buffer洗絳一 次；
[0048] 2.加入400 μ LAL buffer，加入20 μ L蛋白酶K，在恒溫加熱器上溫育56°C直到完 全溶解；
[0049] 3.在離心管中加入400 μ L無水乙醇，渦旋5秒，短暫離心；
[0050] 4.將離心管中液體小心轉(zhuǎn)移至QIAamp Mini柱中，8000rpm離心Imin,將QIAamp Mini柱放置于一個收集管中，并將原收集管拋棄；
[0051] 5.加入 500 μ Lbuffer AWlBuffer,蓋上管蓋后，8000rpm 離心 Imin,將 QIAamp Mini柱放置于一個收集管中，并將原收集管拋棄；
[0052] 6.加入 500 μ L buffer AW2Buffer,蓋上管蓋后，HOOOrpm 離心 3min,將 QIAamp Mini柱放置于一個收集管中，并將原收集管拋棄；
[0053] 7. HOOOrpm離心3min，將QIAamp Mini柱放置于新的I. 5ml離心管中，去掉收集 管，加入 50 μ L AE buffer,室溫溫育 lmin, 8000rpm 離心 Imin;
[0054] 8.拋棄QIAamp Mini柱，將洗脫后離心管做好標記保存樣本。
[0055] 實施例二
[0056] 利用Ll通用引物序列擴增。
[0057] I) Ll通用擴增實驗反應(yīng)體系：
[0058] 使用 0· 125 μ L LA Taq (5U/ μ L) (TaKaRa，RR02MB)、2. 5 μ L IOxPCR Buffer (Mg2+) (TaKaRa, RR02MB)、2 μ L dNTP Mixture (各2. 5mM) (TaKaRa, RR02MB)，I μ L DM (要求實施例 一獲得的DNA濃度為IOng/yL以上）、上下游引物（10 μ Μ)各I yL和自制雙蒸水，混合配 制25 μ L反應(yīng)體系。
[0059] 2)反應(yīng)條件：
[0060] 使用普通 PCR 儀（Applied Biosystems，Veritili: 96-Well Thermal Cycler) 進行 PCR 反應(yīng)，反應(yīng)條件如下：94 °C for 5minutes, (94 °C for 30seconds, 55 °C for 30seconds, 72°C for 30seconds,) 30 個循環(huán)，12°C保溫
[0061] 3)擴增結(jié)果：
[0062] 使用I %瓊脂糖凝膠（Agarose)在電壓140V,電流75mA的情況下電泳30min后， 進行溴化乙錠染色10分鐘后，在Tanonl600全自動數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)上進行觀察。電 泳結(jié)果如圖1所示，從左至右依次為marker、上述PCR反應(yīng)擴增產(chǎn)物和陰性對照，上述PCR 反應(yīng)擴增產(chǎn)物泳道顯示有HPV Ll基因條帶，表明樣本感染有HPV。
[0063] 實施例三
[0064] 其他HPV基因組序列擴增。
[0065] 1)擴增實驗反應(yīng)體系：
[0066] 使用 0. 25 μ LLA Taq(5U/yL) (TaKaRa, RRO 2 MB) , 2. 5 μ L IOx PCR Buffer (Mg2+Plus) (TaKaRa, RR02MB)、4 μ L dNTP Mixture (各 2. 5mM) 〇^1(&1^，1^021^)，1以0)嫩（要求實施例一獲得的0嫩濃度為10叩/^1^以上）、上下游引物 (10 μ M)各I μ L和自制雙蒸水，混合配制25 μ L反應(yīng)體系。
[0067] 2)反應(yīng)條件：
[0068] 使用普通 PCR 儀（Applied Biosystems，Veritili 96-Well Thermal Cycler) 進行 PCR 反應(yīng)，反應(yīng)條件如下：94 °C for 7minutes, (94 °C for 30seconds, 54 °C for 30seconds, 72°C for 6minutes,) 30 個循環(huán)，12°C保溫。
[0069] 3)擴增結(jié)果：
[0070] 使用2 %瓊脂糖凝膠（Agarose)在電壓140V,電流75mA的情況下電泳30min后， 進行溴化乙錠染色10分鐘后，在Tanonl600全自動數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)上進行觀察。
[0071] 根據(jù)圖2所示的膠圖結(jié)果進行HPV病毒分型，圖中16表示HPV16,18表示HPV18， 以此類推，從圖中可以看出在HPV16型及HPV31型出現(xiàn)約8Kb左右的條帶，因此認為本樣本 感染型別為HPV16/31。
[0072] 實施例四
[0073] 病毒基因組擴增產(chǎn)物純化，用AMPure DNA Purif ication kit (SPRI beads)純化 擴增后的樣品。
[0074] L取出4°C保存的AMPure Beeds，室溫放置30min平衡。
[0075] 2.振蕩均勾，按照樣品體積1. 5倍加入至I. 5mL管中。
[0076] 3.取出PCR產(chǎn)物，并放置在磁力架上，吸取上清；對應(yīng)加入上清充分混勾，靜置 IOmin,瞬時離心3秒。
[0077] 4.將I. 5mL離心管轉(zhuǎn)移放置在磁力架上，靜置5-10min至澄清。
[0078] 5.吸取上清后，加入500 μ L 70%乙醇，將磁珠吹起混勻后吸附，棄上清，重復一 次。
[0079] 6.置37°C干燥，至磁珠干裂。
[0080] 7.往I. 5mL離心管中加入20 μ L去離子水，充分混勾，靜置5min，然后置于磁力架 約5min至澄清。
[0081] 實施例五
[0082] 獲得病毒基因組
[0083] 1)病毒序列混合
[0084] 將實施例四中的純化產(chǎn)物進行 Qubit (Life Technologies, Grand Island, NY) 定量，并根據(jù)定量結(jié)果，按照以下公式計算拷貝數(shù)（copies)，（6.02X 1023)X(g/mlV(DNA lengthX660) = copies/ml，根據(jù)拷貝數(shù)對樣本進行等量混合。
[0085] 2)基因組DNA的片段化
[0086] 使用超聲法（Covaris，S2)將獲得的基因組DNA片段化為大小約200bp的片段。
[0087] 3)DNA片段的末端修復以及3'連接〃A〃堿基<