一種半乳甘露聚糖抗原及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及抗原制備領(lǐng)域，特別涉及一種半乳甘露聚糖抗原及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 半乳甘露聚糖（Galactomannan，簡(jiǎn)稱GM)存在于真菌（如曲霉菌屬、青霉菌屬等） 及胚乳豆類植物（如萌蘆巴、瓜兒豆、角豆等）細(xì)胞壁中，廣泛應(yīng)用于食品和醫(yī)學(xué)、臨床領(lǐng) 域。
[0003] 目前，由于抗生素和免疫制劑的大量使用，真菌感染呈逐年上升趨勢(shì)，其中，曲霉 特別是煙曲霉已經(jīng)逐漸成為臨床上一種重要的致病真菌。半乳甘露聚糖作為曲霉菌細(xì)胞壁 的骨架，同時(shí)也是曲霉分泌性抗原，半乳甘露聚糖抗原被認(rèn)為是侵襲性曲霉病早期診斷的 靶標(biāo)。因此，獲得特異性的抗半乳甘露聚糖的抗體，對(duì)于曲霉病的診斷具有重要的意義，然 而，采用重組半乳甘露聚糖抗原制備得到的抗體，僅部分能與煙曲霉菌絲體中的半乳甘露 聚糖抗原位點(diǎn)特異結(jié)合，采用天然半乳甘露聚糖抗原可能解決該問(wèn)題，然而，目前天然半乳 甘露聚糖抗原提純存在一定困難。
[0004] 現(xiàn)有技術(shù)中，天然半乳甘露聚糖抗原主要從煙曲霉菌培養(yǎng)液中分離，提取的半乳 甘露聚糖抗原主要為粗提物，使用乙醇沉淀培養(yǎng)液上清液，再用乙醇清洗醇沉后的組分，得 到抗原粗提物。然而，當(dāng)半乳甘露聚糖作為用于制備抗體的抗原使用時(shí)，由于粗提物中含有 糖胺、蛋白等雜質(zhì)，無(wú)法滿足抗體制備的要求，現(xiàn)有技術(shù)中也有對(duì)粗提物進(jìn)行進(jìn)一步純化的 研宄，例如申請(qǐng)?zhí)枮镃N201110289099. 8的中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)公開了將半乳甘露聚糖粗提 物進(jìn)行超濾處理，將小于一定分子量的蛋白質(zhì)、雜糖和糖蛋白濾除，從而得到純度90%以上 的半乳甘露聚糖抗原。然而，使用該方法對(duì)半乳甘露聚糖進(jìn)行純化，僅能除去分子量明顯小 于半乳甘露聚糖分子量的雜質(zhì)，當(dāng)雜糖或蛋白質(zhì)的含量與半乳甘露聚糖分子相近或大于半 乳甘露聚糖分子時(shí)，則無(wú)法濾除。此外，現(xiàn)有技術(shù)中也有通采用肼解、水解或?qū)游龅姆绞綄?duì) 粗提物進(jìn)行提純，然而，該純化主要用于半乳甘露聚糖結(jié)構(gòu)的表征，無(wú)法保證半乳甘露聚糖 的純度及合適的分子量分布，不利于產(chǎn)業(yè)批量生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種純度更高且適于批量生產(chǎn)的半乳甘露聚糖抗原及其制 備方法。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0007] -種半乳甘露聚糖抗原的制備方法，包括如下步驟：
[0008] (a)富含半乳甘露聚糖的生物體經(jīng)破碎、離心、醇沉、洗滌、干燥處理，分離得到半 乳甘露聚糖粗提物；
[0009] (b)將步驟（a)制得的半乳甘露聚糖粗提物依次進(jìn)行肼解、水解；
[0010] (C)將步驟（b)中的水解產(chǎn)物中加入酶進(jìn)行酶解，并除去酶解產(chǎn)物中的酶及小分 子物質(zhì)；
[0011] (d)將步驟（c)得到的產(chǎn)物經(jīng)離子交換柱、親和層析柱及凝膠色譜純化，得到半乳 甘露聚糖抗原純品。對(duì)得到的半乳甘露聚糖抗原純品，進(jìn)行鑒定。
[0012] 優(yōu)選的，所述生物體包括生物種群、個(gè)體或者離體組織，具體的包括真菌或胚乳豆 類植物；所述真菌包括曲霉菌、毛霉菌、青霉菌、珠菌、念珠菌等，所述胚乳豆類植物包括萌 蘆巴、瓜兒豆、角豆、刺槐豆、關(guān)華豆、皂莢、海紅豆、銀合歡等。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，所述生 物體只要富含半乳甘露聚糖即可，并不限于上述具體生物。
[0013] 在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，優(yōu)選的，所述步驟（a)具體包括：將富含半乳甘露聚糖 的生物體培養(yǎng)到半乳甘露聚糖含量最高時(shí)，滅活處理；過(guò)濾，將滅活后的生物體與培養(yǎng)液和 /或組織液分離，生物體進(jìn)行細(xì)胞破碎、離心，將細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞壁分離，得到有效組分；所述 有效組分經(jīng)過(guò)醇沉，洗滌，干燥等工藝處理，得到半乳甘露聚糖粗提物。其中，所述有效組分 是指富含半乳甘露聚糖的組分，如曲霉菌的發(fā)酵液、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞壁成分，富含半乳甘露聚 糖的植物膠（如萌蘆巴膠、塔拉膠、刺槐豆膠、角豆膠、瓜兒豆膠、關(guān)華豆膠等）。
[0014] 優(yōu)選的，所述生物體培養(yǎng)過(guò)程中使的培養(yǎng)基選自PDA培養(yǎng)基、沙氏培養(yǎng)基、察氏培 養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基等培養(yǎng)基中的一種或多種。培養(yǎng)方法包括使用固體培養(yǎng)基的平板培養(yǎng) 和斜面培養(yǎng)，使用液體培養(yǎng)基的搖瓶振蕩培養(yǎng)和發(fā)酵罐培養(yǎng)等，溫度20-40°C，時(shí)間3-15 天。
[0015] 優(yōu)選的，所述滅活方法包括化學(xué)試劑、射線、高溫、高滲透壓等。
[0016] 優(yōu)選的，所述細(xì)胞破碎使用機(jī)械破碎法、溶脹法、酶解法等方法中的一種或多種。
[0017] 優(yōu)選的，醇沉使用甲醇或者乙醇，醇沉的體積為有效組分溶液體積的2-6倍，醇沉 時(shí)間為1-48小時(shí)。更優(yōu)選的，醇沉體積為4倍有效組分溶液體積，醇沉?xí)r間為6-24小時(shí)。
[0018] 優(yōu)選的，洗滌使用甲醇或者乙醇；干燥方法為烘干、凍干、減壓干燥中的一種或多 種。
[0019] 在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，優(yōu)選的，所述步驟（a)還包括活性炭脫色。
[0020] 具體的，將有效組分溶于水中，加入活性炭粉末，室溫脫色6-24小時(shí)，待溶液棕黃 色褪去，漏斗過(guò)濾，濾液經(jīng)0. 22 μ m濾膜過(guò)濾，即得到去除色素的半乳甘露聚糖提取物。優(yōu) 選的，每毫升溶液中加入〇. 02-0. 05g活性炭。
[0021] 在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，優(yōu)選的，所述步驟（b)中肼解時(shí)：每毫克半乳甘露聚糖 粗提物中加10-100 μ 1的無(wú)水肼，肼解溫度為100-150°C，肼解時(shí)間為2-12小時(shí)。更優(yōu)選 的，所述肼解溫度為110_130°C肼解時(shí)間為3-8小時(shí)。
[0022] 優(yōu)選的，所述步驟（b)中肼解具體包括：向每毫克半乳甘露聚糖粗提物中加 10-100 μ 1入無(wú)水肼，混勻，密封，在100-150°C下保溫2-12小時(shí)；將所得的肼解產(chǎn)物加入乙 醇進(jìn)行離心、洗滌和冷凍干燥，得到肼解后的干粉。
[0023] 在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，優(yōu)選的，所述步驟（b)中水解采用亞硝酸水解，亞硝酸 水解時(shí)亞硝酸濃度為I. 5-5. 0m〇l/L，水解溫度為30°C，水解時(shí)間為2-12小時(shí)，水解結(jié)束后 通入空氣。更優(yōu)選的，所述亞硝酸濃度為I. 6-2. 4mol/L，水解時(shí)間為3-8小時(shí)。
[0024] 優(yōu)選的，所述步驟（b)中水解具體包括：將肼解后的干粉加入濃度為I. 5-5. Omol/ L，水解溫度為30°C，水解時(shí)間為2-12小時(shí)，水解結(jié)束后通入空氣；水解液經(jīng)水透析過(guò)夜，透 析液中加入乙醇進(jìn)行離心、洗滌和冷凍干燥，得到水解后的干粉。
[0025] 經(jīng)肼解和水解后，有效除去半乳甘露聚糖中的蛋白和氨基；并通過(guò)對(duì)肼解、水解條 件的優(yōu)化，使肼解和水解過(guò)程中半乳甘露聚糖的損失量較小，且蛋白殘余量不足4%。
[0026] 在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，優(yōu)選的，步驟（C)中，所述酶選自葡聚糖酶、纖維素酶、 果膠酶、幾丁質(zhì)酶中的一種或多種，酶解緩沖液為0.0 lM PBS，pH為7. 4,溫度為20-60°C，酶 解時(shí)間為6-48小時(shí)。更優(yōu)選的，所述酶解溫度為30-45°C，酶解時(shí)間為12-24小時(shí)。
[0027] 優(yōu)選的，所述步驟（c)中酶解具體包括：將水解后的干粉制備成溶液，加入濃度 為2-5%的葡聚糖酶、纖維素酶、果膠酶、幾丁質(zhì)酶等中的一種或者種，酶解緩沖液為0.0 lM PBS，pH為7. 4,在20-60°C下酶解6-48小時(shí)；采用sevage法（加入正丁醇和氯仿溶液，振 蕩，離心）除去酶，采用透析、超濾或Sephadex G分子篩等方法除去小分子物質(zhì)。
[0028] 通過(guò)酶解除去產(chǎn)物中混雜的葡聚糖、幾丁質(zhì)、纖維素、果膠等多糖雜質(zhì)，進(jìn)一步提 高了半乳甘露聚糖的純度。
[0029] 在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，優(yōu)選的，步驟（d)中，離子交換柱為陰離子交換柱。
[0030] 優(yōu)選的，陰離子交換柱為Mono Q陰離子交換柱，緩沖液和溶劑均為TriS-HCl緩沖 液、PH為7~8.5、溫度4°C。
[0031] 由于半乳甘露聚糖純品不帶電荷，帶負(fù)電荷的蛋白、核酸等被陰離子交換柱吸附， 進(jìn)一步消除步驟（b)中殘余的蛋白及核酸。
[0032] 在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，優(yōu)選的，步驟（d)中，親和層析柱為Con A-Sepharose 4B親和層析柱。其中，緩沖液為PH 7-8. 5 (優(yōu)選為PH7. 4)的Tris-HCl緩沖液（溶質(zhì)為 0· 5mol/L NaCl、lmmol/L CaCl2、lmmol/L MgCl2)，溫度 4°C，洗脫液為 PH 8-8. 5