試管內(nèi)物 質(zhì)充分混和后，7〇°C水浴加熱lOmin，然后冷卻至室溫。在530nm處測定吸光度。以100mg/L 氨基葡萄糖作為標準品，水代替樣品，同上處理作測定用的空白對照，530nm處測定吸光度。 檢測結(jié)果如下表3 :
[0118] 表3:氨基己糖濃度測定
[0119]
[0120] 經(jīng)測定水解液中不存在氨基己糖成分，由此可見，本發(fā)明方法提取純品中不存在 糖蛋白。
[0121] 2.色譜分析
[0122] (1)紫外吸收光譜分析多糖組分
[0123] 對本發(fā)明的制備方法得到的半乳甘露聚糖抗原純化樣品進行紫外吸收檢測。分別 在260nm、280nm和320nm波長下檢測樣本，結(jié)果如下表4。
[0124] 表4 :半乳甘露聚糖DNA、蛋白質(zhì)和多糖測定結(jié)果
[0125]
[0126] 由表4檢測結(jié)果可知，核酸及蛋白質(zhì)的總含量與多糖含量的比例小于5%，亦即核 酸及蛋白質(zhì)含量小于總物質(zhì)含量的5%，不超過樣本總質(zhì)量的5%。
[0127] (2)示差折光法分析多糖組成
[0128] 對本發(fā)明的制備方法得到的半乳甘露聚糖抗原純化樣品進行HPLC檢測，檢測器 為示差折光檢測器，結(jié)果如附圖2。從圖2中可看出，樣品出峰單一，尖窄，并且無明顯雜峰， 說明本發(fā)明提取的物質(zhì)大小均一，純度較高。
[0129] (3)液相色譜分析多糖中單糖組分
[0130] 對本發(fā)明的制備方法得到的半乳甘露聚糖抗原純化樣品，三氟乙酸水解，再用 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮對水解后單糖進行衍生化。檢測波長為250nm，結(jié)果如附圖 3所示。從圖3中可看出，除衍生峰外，只含有少量葡萄糖，無其它單糖雜峰。由此證明，本 發(fā)明方法獲得的多糖主要成分為半乳甘露聚糖，其它多糖含量極低。
[0131] (4)免疫學活性鑒定
[0132] 采用美國Bio-Rad公司的煙曲霉抗原檢測試劑盒對本發(fā)明的方法制備的半乳甘 露聚糖抗原樣品進行檢測，樣本濃度為lng/ml。檢測結(jié)果呈陽性，且OD值大于陽性質(zhì)控。 說明用本發(fā)明中的方法可以獲得煙曲霉的半乳甘露聚糖具有免疫學活性。結(jié)果見下表5 :
[0133] 表5 :半乳甘露聚糖免疫活性測定
[0134]
[0135] 數(shù)據(jù)顯示，用本發(fā)明純化的煙曲霉半乳甘露聚糖抗原純度高且分子量分布均勻， 具備免疫活性。
[0136] (5)多糖分子量測定
[0137] 采用高效凝膠色譜法測定不同分子量的標準葡聚糖保留時間tR，檢測器為示差折 光檢測器，數(shù)據(jù)見表6。以標準葡聚糖重均分子量的對數(shù)IgMw對保留時間tR進行回歸處 理，繪制重均分子量標準曲線，結(jié)果見圖4,標準曲線方程：tR = 33. 95188-3. 74663*logMw， R2= 0.99957。用高效凝膠色譜法對本發(fā)明制備方法得到的半乳甘露聚糖純化樣品進行測 定，結(jié)果見圖5,得到保留時間t%= 17. 815,將其代入標準曲線，得到半乳甘露聚糖分子量 Mw 為 20279Da。
[0138] 表6標準葡聚糖的tR表
[0140] 數(shù)據(jù)顯示，用本發(fā)明純化的煙曲霉半乳甘露聚糖抗原純度高且分子量分布均勻。
[0141] 上述實施例只為說明本發(fā)明的技術構(gòu)思及特點，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā) 明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【主權項】
1. 一種半乳甘露聚糖抗原的制備方法，包括如下步驟： (a) 富含半乳甘露聚糖的生物體經(jīng)破碎、離心、醇沉、洗滌、干燥處理，分離得到半乳甘 露聚糖粗提物； (b) 將步驟（a)制得的半乳甘露聚糖粗提物依次進行肼解、水解； (c) 將步驟（b)中的水解產(chǎn)物中加入酶進行酶解，并除去酶解產(chǎn)物中的酶及小分子物 質(zhì)； (d) 將步驟（c)得到的產(chǎn)物經(jīng)離子交換柱、親和層析柱及凝膠色譜純化，得到半乳甘露 聚糖抗原純品。2. 如權利要求1所述的半乳甘露聚糖抗原的制備方法，其特征在于：所述生物體包括 真菌或胚乳豆類植物；優(yōu)選的，所述真菌包括曲霉菌、毛霉菌、青霉菌、珠菌或念珠菌，所述 胚乳豆類植物包括萌蘆巴、瓜兒豆、角豆、刺槐豆、關華豆、皂莢、海紅豆或銀合歡。3. 如權利要求1或2所述的半乳甘露聚糖抗原的制備方法，其特征在于：所述步驟（a) 包括：將富含半乳甘露聚糖的生物體培養(yǎng)到半乳甘露聚糖含量最高時，滅活處理；過濾，將 滅活后的生物體與培養(yǎng)液和/或組織液分離，生物體進行細胞破碎、離心，將細胞質(zhì)和細胞 壁分離，得到有效組分；所述有效組分經(jīng)過醇沉，洗滌，干燥工藝處理，得到半乳甘露聚糖粗 提物； 或者，所述步驟（a)包括：將生物體進行破碎，加水浸提，過濾，有效組分經(jīng)醇沉，洗滌、 干燥工藝處理，得到半乳甘露聚糖粗提物。4. 如權利要求3所述的半乳甘露聚糖抗原的制備方法，其特征在于：所述步驟（a)中， 生物體培養(yǎng)過程中使用的培養(yǎng)基選自PDA培養(yǎng)基、沙氏培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基 中的一種或多種；培養(yǎng)方法選自使用固體培養(yǎng)基的平板培養(yǎng)或斜面培養(yǎng)，或使用液體培養(yǎng) 基的搖瓶振蕩培養(yǎng)或發(fā)酵罐培養(yǎng)。5. 如權利要求3所述的半乳甘露聚糖抗原的制備方法，其特征在于：所述步驟（a)中， 滅活方法包括化學試劑、射線、高溫、高滲透壓； 和/或，所述步驟（a)中，所述細胞破碎使用機械破碎法、溶脹法、酶解法中的一種或多 種； 和/或，所述步驟（a)中，所述醇沉使用甲醇或者乙醇，醇沉的體積為有效組分溶液體 積的2-6倍，醇沉時間為1-48小時； 和/或，所述步驟（a)中，所述洗滌使用甲醇或者乙醇；干燥方法為烘干、凍干、減壓干 燥中的一種或多種。6. 如權利要求1或2所述的半乳甘露聚糖抗原的制備方法，其特征在于：所述步驟（a) 還包括活性炭脫色。7. 如權利要求1或2所述的半乳甘露聚糖抗原的制備方法，其特征在于：所述步驟（b) 中肼解時：每毫克半乳甘露聚糖粗提物中加IO-IOOuL的無水肼，肼解溫度為100-150°C， 肼解時間為2-12小時； 和/或，所述步驟（b)中水解時，采用亞硝酸水解，亞硝酸水解時亞硝酸濃度為 I. 5-3. Omol/L，水解溫度為30°C，水解時間為2-12小時，水解結(jié)束后通入空氣。8. 如權利要求1或2所述的半乳甘露聚糖抗原的制備方法，其特征在于：所述步驟 (c)中，所述酶選自葡聚糖酶、纖維素酶、果膠酶、幾丁質(zhì)酶中的一種或多種，酶解溫度為 20-60°C，酶解時間為6-48小時； 和/或，所述步驟（c)中，加入正丁醇和氯仿溶液，振蕩，離心，除去酶，采用透析、超濾 或分子篩除去小分子物質(zhì)。9. 如權利要求1或2所述的半乳甘露聚糖抗原的制備方法，其特征在于：所述步驟（d) 中，離子交換柱為陰離子交換柱，緩沖液為PH為7~8. 5的Tris-HCl緩沖液，溫度4°C ; 和/或，所述步驟（d)中，親和層析柱為Con A-Sepharose 4B親和層析柱，緩沖液為PH 7~8. 5的Tris-HCl緩沖液，溫度4°C，洗脫液為PH 8~8. 5的濃度為0. 2~0. 3mol/L的 a -甲基-D-甘露糖苷； 和/或，所述步驟（d)中，凝膠色譜柱選自葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠、纖維素凝膠、聚丙 烯酰胺凝膠中。10. -種半乳甘露聚糖抗原，其特征在于：采用如權利要求1-9任一項所述的半乳甘露 聚糖抗原的制備方法制備得到。11. 如權利要求10所述的半乳甘露聚糖抗原在制備半乳甘露聚糖多克隆抗體或制備 用于檢測侵襲性真菌疾病檢測試劑盒中的應用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種半乳甘露聚糖抗原的制備方法，將富含半乳甘露聚糖的生物體經(jīng)破碎、離心、醇沉、洗滌、干燥處理，分離得到半乳甘露聚糖粗提物；將制得的半乳甘露聚糖粗提物依次進行肼解、水解；向水解產(chǎn)物中加入酶進行酶解，并除去酶解產(chǎn)物中的酶及小分子物質(zhì)；產(chǎn)物經(jīng)離子交換柱、親和層析柱及凝膠色譜純化，得到半乳甘露聚糖抗原純品；對得到的半乳甘露聚糖抗原純品，進行鑒定。使用本發(fā)明制備方法得到的半乳甘露聚糖抗原純度高，消除了半乳甘露聚糖粗提物中可能含有的半乳糖胺、蛋白、雜糖等的干擾，可用于煙曲霉菌抗體的制備。
【IPC分類】C08B37/00
【公開號】CN104945527
【申請?zhí)枴緾N201510387287
【發(fā)明人】周澤奇, 劉春龍, 翟栓柱, 張舟, 李寧, 粟艷
【申請人】丹娜（天津）生物科技有限公司
【公開日】2015年9月30日
【申請日】2015年7月3日