一種具有水稻子房特異性的dna片段的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)和植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及能夠在水 稻轉(zhuǎn)基因調(diào)控體系中特異性的驅(qū)動目標(biāo)基因的表達(dá)的一段DNA片段。
【背景技術(shù)】
[0002] 人類通過對自然突變基因和重組體的選擇與利用，對作物的品種進(jìn)行改良已有近 千年的歷史。近百年來，通常采用人工雜交的方法，實(shí)現(xiàn)優(yōu)良基因的重組和外源基因的導(dǎo)入 培育作物新品種。雜交育種技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)種內(nèi)基因轉(zhuǎn)移，但是，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的品種之間的 基因轉(zhuǎn)移則存在障礙；另一方面，雜交育種技術(shù)不能準(zhǔn)確選擇和操縱某個(gè)基因。因此，增加 了育種結(jié)果的復(fù)雜性。
[0003] 通過轉(zhuǎn)基因的手段進(jìn)行作物品種的選育，其優(yōu)勢在于轉(zhuǎn)基因不受生物體間親緣關(guān) 系的限制，從轉(zhuǎn)基因的技術(shù)角度來講，候選轉(zhuǎn)化的基因來源幾乎不受限制。此外，轉(zhuǎn)基因技 術(shù)所操作和轉(zhuǎn)移的基因是功能明確、控制目標(biāo)性狀的基因，這使得轉(zhuǎn)基因后代的表型更具 有可預(yù)見性。目前轉(zhuǎn)基因技術(shù)已經(jīng)成為作物品種改良的重要手段，轉(zhuǎn)基因大豆、玉米、棉花 和油菜的種植面積已達(dá)4種作物全球總種植面積的25%。
[0004] 在植物的轉(zhuǎn)基因中需要兩個(gè)必需的元件，即啟動子和目的基因。啟動子是位于基 因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的順式調(diào)控元件，與反式作用因子結(jié)合，通過識別因子與RNA聚合酶 的相互作用，啟動基因的轉(zhuǎn)錄；因此，啟動子調(diào)控基因的表達(dá)模式，即目的基因表達(dá)的時(shí)空 特異性及表達(dá)強(qiáng)度，是轉(zhuǎn)基因成敗或成效高低的關(guān)鍵因素之一。
[0005] 針對轉(zhuǎn)基因的目的不同，轉(zhuǎn)化的基因選擇不同的表達(dá)模式，主要包括組成型高表 達(dá)、組織特異性表達(dá)及誘導(dǎo)型表達(dá)等。如在棉花、玉米、水稻等農(nóng)作物中轉(zhuǎn)入蘇云金芽孢桿 菌的抗蟲蛋白采用的是組成型高表達(dá)方式，在作物中高劑量表達(dá)Bt抗蟲蛋白的優(yōu)勢在于 高劑量可以確保殺蟲的效果，同時(shí)有利于延長Bt抗蟲蛋白的有效期。在金稻谷的創(chuàng)制過程 中，其目標(biāo)是通過在水稻胚乳中引入了維生素 A前體的合成途徑，從而在稻米中強(qiáng)化維生 素 A，解決維生素 A營養(yǎng)缺乏的問題；因此，轉(zhuǎn)基因時(shí)采用的啟動子為在水稻胚乳中特異表 達(dá)的谷蛋白啟動子。在植物抗病基因的轉(zhuǎn)化中，常采用病原菌誘導(dǎo)表達(dá)的啟動子。
[0006] 水稻是單子葉植物禾谷類的代表植物，不同于雙子葉植物，且具有單子葉植物的 多項(xiàng)優(yōu)勢，是研宄花發(fā)育的理想材料，但水稻花發(fā)育機(jī)制的研宄卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于雙子葉植物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 因此，針對上述問題，本發(fā)明針對水稻花發(fā)育機(jī)制進(jìn)行了仔細(xì)研宄。并且在研宄過 程，側(cè)重于水稻子房中相關(guān)基因的表達(dá)，獲得一個(gè)DNA片段，其具有子房表達(dá)特異性，可以 用于驅(qū)動在子房中特異性表達(dá)的一些功能基因或結(jié)構(gòu)基因，這對于水稻穗的品質(zhì)改良及水 稻的產(chǎn)量的提高具有重要的意義。
[0008] 本發(fā)明的還獲得了獲得含有上述DNA片段的表達(dá)盒和重組載體，并且本發(fā)明還利 用該DNA片段獲得了相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因植物。其中，本文中所涉及的"植物"是指單子葉植物， 例如水稻、小麥、玉米、大麥、高梁或燕麥，優(yōu)選為水稻。
[0009] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，一方面，本發(fā)明提供一種DNA片段，所述DNA片段包含：
[0010] 1)序列表中SEQ ID NO :1所示的DNA序列；或者
[0011] 2)在嚴(yán)格條件下與1)中所述的DNA序列雜交且具有啟動子功能的DNA分子；或 者
[0012] 3)與1)或2)限定的DNA序列具有90%以上的同源性，且具有啟動子功能的DNA 分子。
[0013] 2)和3)中的序列與SEQ ID No: 1所示的DNA序列具有相同的功能，即驅(qū)動目標(biāo)基 因在植物中表達(dá)，其中，
[0014] SEQ ID NO :1中所示序列為：

[0017] 需要說明的是：上述啟動子的DNA序列中，序列開頭的序列" tccacaggat tcacaataac gt"共計(jì)22bp為獲得啟動子過程中使用的正向引物的留存序列；序列末尾的 序列"at tgcctctacc atactcggtg"共計(jì)22bp為獲得啟動子過程中使用的反向引物的留存 序列（該留存序列與反向引物的相應(yīng)序列互補(bǔ)）；該DNA序列中剩余的部分則為獲自日本 晴水稻中的DNA序列。需要強(qiáng)調(diào)的是，本文中所提到的啟動子既可以指上述整個(gè)DNA序列， 也可以指去除上述引物留存序列后的DNA序列。需要說明的是，即便本領(lǐng)域技術(shù)人員在本 發(fā)明的基礎(chǔ)上，采用其他引物獲得了類似序列，其也落入本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0018] 優(yōu)選地，本發(fā)明所述DNA序列為SEQ ID No: 1所示的序列。
[0019] 優(yōu)選地，序列表中SEQ ID No: 1所示的DNA序列用作水稻子房特異表達(dá)啟動子。
[0020] 序列表中SEQ ID No: 1所示的DNA序列可以提取自水稻屬植物，優(yōu)選為日本晴水 稻（Oryza sativa L cv.Nipponbare)，本文中稱為OsOval或啟動子OsOval。具體而言，本 申請的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)日本晴水稻（Oryza sativa L cv. Nipponbare)基因上游包括轉(zhuǎn)錄起始 位點(diǎn)在內(nèi)的1970bp的DNA序列，具有驅(qū)動目標(biāo)基因在水稻子房中特異性表達(dá)的功能，并且 分離克隆、并鑒定了該DNA序列的功能。但是，需要說明的，后續(xù)人們根據(jù)本發(fā)明公開內(nèi)容 而人工合成的相同序列也包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0021] 另一方面，本發(fā)明還提供一種包含上述水稻子房特異性強(qiáng)表達(dá)啟動子的表達(dá)盒。
[0022] 另一方面，本發(fā)明還提供一組用于擴(kuò)增權(quán)利要求1所述的DNA片段的全長或其 任意片段的引物對，其特征在于，所述引物對包括第一引物和第二引物，所述第一引物 的DNA序列包含片段：TCCACAGGATTCACAATAACGT ;所述第二引物的DNA序列包含片段： ATTGCCTCTACCATACTCGGTG。
[0023] 又一方面，本發(fā)明還提供一種重組表達(dá)載體，所述重組表達(dá)載體為在植物表達(dá)載 體PCAMBIA1391的多克隆位點(diǎn)插入所述DNA片段得到的重組質(zhì)粒，在所述重組表達(dá)載體中， 所述水稻子房特異表達(dá)啟動子OsOval連接于載體中待表達(dá)的基因序列的上游；優(yōu)選的，所 述待表達(dá)的基因?yàn)閷λ咀臃坑懈纳乒δ艿幕?。通過本發(fā)明的啟動子驅(qū)動基因在子房中 特異性表達(dá)，從而達(dá)到改良作物性狀的作用。
[0024] 再一方面，本發(fā)明提供上述水稻子房特異性強(qiáng)表達(dá)啟動子在培育轉(zhuǎn)基因植物中的 應(yīng)用。所述應(yīng)用包括將本發(fā)明提供的上述水稻子房特異性強(qiáng)表達(dá)啟動子連接于載體的待 表達(dá)的基因序列上游（例如，將所述啟動子序列置于目標(biāo)基因之前），從而構(gòu)建重組表達(dá)載 體，將所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞、組織或器官中進(jìn)行培育。
[0025] 綜上所述，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)、提取并鑒定了日本晴水稻（Oryza sativa L cv. Nipponbare) OsOval基因上游包括轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)在內(nèi)的1970bp的DNA序列，并將其命名 為啟動子OsOval。將該序列經(jīng)酶切后連接到植物雙元表達(dá)載體pCAMBIA1391上，獲得相應(yīng) 的重組質(zhì)粒（即重組表達(dá)載體），利用該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105,然后用農(nóng)桿 菌介導(dǎo)的方法進(jìn)行水稻的轉(zhuǎn)化，得到轉(zhuǎn)基因水稻植株。對獲得的轉(zhuǎn)基因水稻進(jìn)行Gus組織 化學(xué)染色檢測發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株僅在子房部位有Gus表達(dá)，從而證明該1970bp的序列具有 驅(qū)動基因在子房部位特異性表達(dá)的活性。
[0026] 本發(fā)明所述的啟動子序列可與植物雙元表達(dá)載體連接，用于取代組成型啟動子。 并且，該啟動子序列可以與所需的靶標(biāo)基因連接，構(gòu)建重組植物表達(dá)載體，經(jīng)轉(zhuǎn)化后，在水 稻的子房部位特異性的驅(qū)動靶標(biāo)基因的表達(dá)，增加轉(zhuǎn)基因的效果，改良水稻的特性。
[0027] 技術(shù)效果
[0028] 本發(fā)明所克隆的水稻啟動子OsOval能夠調(diào)控基因在水稻子房中特異性集中表 達(dá)，在實(shí)際應(yīng)用中具有顯著價(jià)值。通過該啟動子對農(nóng)作物品種進(jìn)行基因改造，如通過該啟動 子驅(qū)動目標(biāo)基因在植株中表達(dá)，可以提高和改善水稻的生殖特性，從而培育出理想的轉(zhuǎn)基 因植物品種。
【附圖說明】
[0029] 以下，結(jié)合附圖來詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施方案，其中：
[0030] 圖1為將OsOval啟動子構(gòu)建于pCAMBIA1391載體質(zhì)粒中的示意圖，其中圖1中A 為PCAMBIA1391示意圖，圖1中B為pCAMBIA1391-0s0val示意圖，其中示出了利用OsOval 啟動子驅(qū)動位于其下游的Gus基因表達(dá)；
[0031] 圖2為對本發(fā)明啟動子進(jìn)行酶切驗(yàn)證的結(jié)果示意圖；
[0032] 圖3為12周苗齡的OsOval::⑶S轉(zhuǎn)基因植株組織染色圖。（標(biāo)尺=5mm)。在根、 莖、葉、鞘組織中均沒有觀察到代表GUS活性的藍(lán)色，而在花中，僅有位于雌蕊基部的子房 中有藍(lán)色出現(xiàn)，而穎殼、雄蕊中也都沒有表現(xiàn)出⑶S活性。
【具體實(shí)施方式】
[0033] 以下參照具體的實(shí)施例來說明本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，這些實(shí)施例僅 用