于說(shuō)明本發(fā)明，其不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0034] 下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的藥 材原料、試劑材料等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為市售購(gòu)買(mǎi)產(chǎn)品。
[0035] 含有酶切位點(diǎn)的OsOval啟動(dòng)子的獲得
[0036] 步驟1、引物的設(shè)計(jì)
[0037] 根據(jù)NCBI中提供的水稻品種日本晴（Oryza sativa L cv. Nipponbare)全基因組 序列，依據(jù)水稻OsOval基因的序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，并根據(jù)選用的載體及靶標(biāo)基因的特點(diǎn)， 設(shè)計(jì)引物的酶切位點(diǎn)。
[0038] 本實(shí)驗(yàn)例中以水稻雙元表達(dá)載體PCAMBIA1391 (來(lái)自于CAMBIA，公開(kāi)使用載體， 安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因生物產(chǎn)品成分監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心水稻組保存）為例，靶標(biāo) 基因?yàn)镚us基因，具體設(shè)計(jì)的引物為：正向引物（SEQ ID N〇:2)5'端帶Hindlll，酶切位點(diǎn) (AAGCTT)，反向引物（SEQ ID No:3)5'端帶EcoRI，酶切位點(diǎn)（GAATTC)，引物序列如下：
[0039] 正向引物：AAGCTTTCCACAGGATTCACAATAACGT HindIII
[0040] 反向引物：GAATTCCACCGAGTATGGTAGAGGCAAT EcoRI
[0041] 由深圳華大基因公司合成。
[0042] 步驟2、啟動(dòng)子OsOval的獲得
[0043] 以水稻品種日本晴DNA為模板，利用正向引物、反向引物擴(kuò)增啟動(dòng)子OsOval，按常 規(guī)PCR體系，采用如下擴(kuò)增程序：
[0044] 95°C預(yù)變性 5min ;95°C變性 30s，58°C退火 30s，72°C延伸 2min30s，循環(huán) 35 次；最 后 72°C延伸 lOmin。
[0045] 回收PCR擴(kuò)增的目的片段，目的片段長(zhǎng)度1970bp，將其連接到PGEM-T-Easy載體 (購(gòu)自Promega公司，按載體說(shuō)明書(shū)中的比例混合）上，按照冷激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL-Blue 感受態(tài)細(xì)胞后，使感受態(tài)細(xì)胞激活，進(jìn)而將目的片段轉(zhuǎn)入到激活的感受態(tài)細(xì)胞，然后，經(jīng)菌 落PCR篩選獲得陽(yáng)性克隆，挑取單克隆菌液提質(zhì)粒，用HindIII和EcoRI進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證， 如圖2所示。將經(jīng)過(guò)鑒定的陽(yáng)性克隆送并Invitrogen公司測(cè)序。驗(yàn)證正確的克隆即為所 要獲得的啟動(dòng)子OsOval，其核酸序列如SEQ ID No: 1所示。
[0046] 棺物表汰裁體的構(gòu)律和農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化
[0047] 從上面"啟動(dòng)子OsOval的獲得"過(guò)程中獲得的陽(yáng)性克隆中提取質(zhì)粒，用HindIII 和EcoRI酶切，回收啟動(dòng)子OsOval片段。同時(shí)利用HindIII和EcoRI對(duì)pCAMBIA1391進(jìn)行 線性化處理、回收PCAMBIA1391，將上述的OsOval片段和pCAMBIA1391片段（pCAMBIA1391 中含有Gus基因）用T4連接酶（購(gòu)于TaKaRa公司）進(jìn)行連接，得到啟動(dòng)子OsOval與Gus 基因融合的植物表達(dá)載體pCAMBIA1391-0s0val，利用凍融法將植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿 菌（Agrobacterium tumefaciens)EHA105(安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因生物產(chǎn)品成分 監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心水稻組保存）。
[0048] 利用啟動(dòng)子OsOval驅(qū)動(dòng)Gus報(bào)告基閔在水稻中表汰
[0049] 步驟1 :農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化
[0050] 將成熟水稻種子去掉穎殼后，用70%酒精浸泡種子lmin，倒掉酒精。用含有1滴 Tween20的50%次氯酸鈉（原液有效氯濃度大于4% )溶液浸泡種子40min (150r/min)。倒 掉次氯酸鈉，無(wú)菌水洗5遍至溶液澄清，無(wú)次氯酸鈉味道。無(wú)菌水浸泡種子過(guò)夜。用解剖刀 沿種子的糊粉層將胚剝下，將胚接種于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。30°C下暗培養(yǎng)11天后將愈傷與 胚乳及胚芽分離，將去芽的狀態(tài)良好、分裂旺盛的初級(jí)愈傷組織進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)3~5天后用于 農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化。
[0051] 采用上述"植物表達(dá)載體的構(gòu)建和農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化"過(guò)程中轉(zhuǎn)入了重組表達(dá)載體 的根癌農(nóng)桿菌進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，獲得OsOval: :GUS轉(zhuǎn)基因水稻植株，該遺傳轉(zhuǎn) 化、轉(zhuǎn)化子篩選及轉(zhuǎn)基因植株再生等參照Yongbo Duan (Yongbo Duan, Chenguang Zhai, et al. An efficient and high-throughput protocol for Agrobacterium mediated transformation based on phOsphomannOse isomerase pOsitive selection in Japonica rice(0ryza sativa L.)[J]. Plant Cell Report, 2012. D0I10. 1007/s00299-01201275-3.) 等提出的方法。
[0052] 步驟2、轉(zhuǎn)基因水稻苗的組織器官染色
[0053] 將轉(zhuǎn)化OsOval啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因水稻的組織器官，即根、莖、葉、花器官分別進(jìn)行 ⑶S染色：將各組織分別浸于⑶S染色液中，37°C，過(guò)夜24小時(shí)，75%乙醇脫色，將組織中的 葉綠素脫掉。然后在解剖顯微鏡下觀察并記錄GUS染色的結(jié)果。結(jié)果如圖3所示，GUS基 因只在轉(zhuǎn)基因水稻幼穗的子房被染色成肉眼可明顯觀測(cè)到的很強(qiáng)的藍(lán)色；而在其它各器官 如根、莖、葉片、葉鞘以及雌蕊的花柱和柱頭中，基本沒(méi)有檢測(cè)到GUS基因的表達(dá)。這表明， 本發(fā)明的啟動(dòng)子能夠在轉(zhuǎn)基因植株的子房中特異性地指導(dǎo)其下游的GUS蛋白表達(dá)，這種表 達(dá)具有子房組織表達(dá)特異性。
[0054] 以上對(duì)本發(fā)明【具體實(shí)施方式】的描述并不限制本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本 發(fā)明作出各種改變或變形，只要不脫離本發(fā)明的精神，均應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的范 圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種DNA片段，其特征在于，所述DNA片段包含： 1) 序列表中SEQIDNO: 1所不的DNA序列；或者 2) 在嚴(yán)格條件下與1)中所述的DNA序列雜交且具有啟動(dòng)子功能的DNA分子；或者 3) 與1)或2)限定的DNA序列具有90%以上的同源性，且具有啟動(dòng)子功能的DNA分子， 其中： SEQIDNO:1中所示序列為：2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA片段，其特征在于，所述DNA片段提取自水稻屬植物，優(yōu) 選為日本晴水稻。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA片段，其特征在于，所述DNA片段用作子房特異啟動(dòng)子。4. 一組用于擴(kuò)增權(quán)利要求1所述的DNA片段的全長(zhǎng)或其任意片段的引物對(duì)，其 特征在于，所述引物對(duì)包括第一引物和第二引物，所述第一引物的DNA序列包含片段： TCCACAGGAITCACAATAACGT;所述第二引物的DNA序列包含片段：CACCGAGTATGGTAGAGGCAAT。5. -種含有權(quán)利要求1所述的DNA片段的重組載體，其特征在于，所述重組表達(dá)載體為 在植物表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)插入權(quán)利要求1所述的DNA片段得到的重組質(zhì)粒，在所述重 組表達(dá)載體中，所述DNA片段連接于載體中待表達(dá)的基因序列的上游。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組載體，其特征在于，所述待表達(dá)基因?yàn)閷?duì)子房部位性狀 具有改善功能的基因。7. -種表達(dá)盒，其特征在于，所述表達(dá)盒包含權(quán)利要求1中所述的DNA片段。8. -種根據(jù)權(quán)利要求1中任意一項(xiàng)所述的DNA片段在培育轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用，其特 征在于，所述應(yīng)用包括：將根據(jù)權(quán)利要求1中所述的DNA片段連接于載體中待表達(dá)的基因序 列上游，從而構(gòu)建重組表達(dá)載體；將所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞、組織或器官中進(jìn)行 培育。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用用于改良植物生長(zhǎng)特性，所述植 物為單子葉植物：水稻、玉米、小麥、大麥、高梁或燕麥。10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述待表達(dá)基因?yàn)閷?duì)子房部位有特定功 能的基因。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)一種DNA片段，所述DNA片段包含：1)、序列表中SEQ ID NO：1所示的DNA序列；或者2)在嚴(yán)格條件下與1)、中所述的DNA序列雜交且具有啟動(dòng)子功能的DNA分子；或者3)、與1)或2)限定的DNA序列具有90％以上的同源性，且具有啟動(dòng)子功能的DNA片段。該DNA片段可以用作子房特異表達(dá)啟動(dòng)子。本發(fā)明還提供了含有該DNA片段的表達(dá)盒、植物表達(dá)載體并將其應(yīng)用于植物基因工程中。該DNA片段對(duì)于水稻生殖發(fā)育的研究具有重要的理論及實(shí)際意義。本發(fā)明在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域?qū)⒕哂袕V闊的應(yīng)用和市場(chǎng)前景。
【IPC分類(lèi)】A01H5/00, C12N15/113, C12N15/82, C12N15/11
【公開(kāi)號(hào)】CN104946651
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510398953
【發(fā)明人】魏鵬程, 楊劍波, 秦瑞英, 李莉, 李 浩, 李娟 , 楊亞春, 許蓉芳, 馬卉
【申請(qǐng)人】安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所
【公開(kāi)日】2015年9月30日
【申請(qǐng)日】2015年7月7日