一種hiv-1基因型和耐藥突變位點(diǎn)的檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種HIV-I基因型和耐藥突變位點(diǎn)的檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用，屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 自1981年美國(guó)首先發(fā)現(xiàn)艾滋?。ˋIDS)由人類免疫缺陷病毒（HIV)感染引起以 來(lái)，艾滋病已在全球迅速蔓延開來(lái)。據(jù)聯(lián)合國(guó)艾滋病計(jì)劃署和世界衛(wèi)生組織聯(lián)合發(fā)布的全 球艾滋病流行情況的報(bào)道中顯示：截止到2009年，全世界感染總?cè)藬?shù)3340萬(wàn)人，新增感染 人數(shù)約為270萬(wàn)人，死亡人數(shù)200萬(wàn)人，210萬(wàn)年齡小于15歲的感染者，全世界每天有超過 7400例新增感染者。而我國(guó)HIV感染人數(shù)每年以3%的速度增長(zhǎng)，流行發(fā)展趨勢(shì)嚴(yán)峻。根 據(jù)衛(wèi)生部2011年發(fā)布的中國(guó)艾滋病疫情估計(jì)報(bào)告顯示，截止到2011年底，中國(guó)存活艾滋病 病毒感染者和艾滋病病人（PLHIV) 78萬(wàn)人。其中AIDS病人15. 4萬(wàn)人。
[0003] 20世紀(jì)90年代以來(lái)，抗艾滋病病毒藥物有了突飛猛進(jìn)的發(fā)展。自1987年第一個(gè) 抗艾滋病毒藥物齊多夫定上市以來(lái)，已發(fā)展到18個(gè)品種，目前向美國(guó)FDA申請(qǐng)的新藥有100 個(gè)之多?？拱滩〔《舅幬锎笾驴梢苑譃楹塑疹惸孓D(zhuǎn)錄酶抑制劑、非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制 劑及蛋白酶抑制劑三大類。隨著高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒聯(lián)合療法（HAART)的開展，對(duì)于延長(zhǎng)艾 滋病感染者的壽命，提高生存質(zhì)量起到了積極作用。在我國(guó)，自從2004年以來(lái)已有多個(gè)地 區(qū)對(duì)艾滋病患者實(shí)施免費(fèi)的高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療，為我國(guó)艾滋病患者帶來(lái)了福音。然而， HIV耐藥病毒株的出現(xiàn)和傳播給艾滋病的抗病毒治療帶來(lái)了極大的困難，已經(jīng)成為影響艾 滋病治療效果的重要原因。對(duì)耐藥性HIV毒株進(jìn)行研宄及檢測(cè)，已經(jīng)成為艾滋病臨床治療 中非常重要的一個(gè)環(huán)節(jié)，對(duì)于減緩耐藥株的產(chǎn)生及傳播，以及指導(dǎo)患者個(gè)體化臨床用藥有 著重要現(xiàn)實(shí)意義。
[0004] 目前，HIV耐藥檢測(cè)主要有兩種方法：表型耐藥檢測(cè)和基因型耐藥檢測(cè)。而基因 型耐藥檢測(cè)最常用，也是最早用于HIV耐藥檢測(cè)的方法之一。基因型耐藥檢測(cè)主要是通 過PCR擴(kuò)增的方法對(duì)HIV基因組中與耐藥相關(guān)的突變的進(jìn)行檢測(cè)，其中基于測(cè)序的方法 對(duì)耐藥突變位點(diǎn)進(jìn)行分析的方法較為流行。HIV-I耐藥位點(diǎn)的研宄主要集中于Pol基因 的蛋白酶基因區(qū)、逆轉(zhuǎn)錄酶基因區(qū)和整合酶基因區(qū)。其中，對(duì)于蛋白酶基因區(qū)和逆轉(zhuǎn)錄酶 基因區(qū)的耐藥位點(diǎn)研宄較為深入，蛋白酶基因區(qū)對(duì)應(yīng)蛋白酶抑制劑耐藥位點(diǎn)（protease inhibitor resistance mutations, Pis)，逆轉(zhuǎn)錄酶基因區(qū)對(duì)應(yīng)核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐 藥位點(diǎn)（nucleoside RT inhibitor resistance mutations, NRTIs)和非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶 抑制劑耐藥位點(diǎn)（non-nucleoside RT inhibitor resistance mutations, NNRTIs)?，F(xiàn)有的 基于測(cè)序的HIV基因型耐藥檢測(cè)體系主要有三大類，包括了雅培公司的ViroSeq? HIV分型 系統(tǒng)、Bayer公司的TRUGENE? HIV-I基因分析系統(tǒng)以及國(guó)內(nèi)外一些大學(xué)或研宄機(jī)構(gòu)建立的 In-house方法。這些檢測(cè)方法的原理大致相同，主要方法是提取HIV核酸，通過單套或多套 引物系統(tǒng)對(duì)病毒基因組中包含蛋白酶和部分逆轉(zhuǎn)錄酶的基因片段進(jìn)行RT-PCR，對(duì)PCR產(chǎn)物 進(jìn)行測(cè)序分析。前兩者已經(jīng)出現(xiàn)商業(yè)化檢測(cè)試劑盒，并被美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市，已經(jīng)成功應(yīng)用 于HIV耐藥檢測(cè)相關(guān)臨床研宄。然而，這兩種檢測(cè)系統(tǒng)主要是針對(duì)歐美流行的B亞型病毒株 進(jìn)行建立的，對(duì)于中國(guó)主要流行的CRF01_AE亞型、B亞型、B'亞型、CRF07_BC亞型、CRF08_ BC亞型或C亞型以及其它流行重組型病毒株的耐藥檢測(cè)效果并不理想。此外，這兩款商業(yè) 化的耐藥檢測(cè)試劑盒價(jià)格昂貴，不利于在我國(guó)大規(guī)模臨床應(yīng)用。而國(guó)內(nèi)一些研宄機(jī)構(gòu)自建 的In-house方法，雖然對(duì)國(guó)內(nèi)的HIV耐藥檢測(cè)起到了一定的作用，但是這些In-house方法 操作繁瑣，更重要的是操作過程和分析方法不統(tǒng)一，難以真正有效的用于大規(guī)模的臨床檢 測(cè)?；谝陨显?，研制開發(fā)一種適用于我國(guó)HIV耐藥檢測(cè)的方法迫在眉睫。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種檢測(cè)待測(cè)HIV-I基因組的基因型或耐藥突變位點(diǎn) 的成套引物。
[0006] 本發(fā)明提供的檢測(cè)待測(cè)HIV-I基因組的基因型或耐藥突變位點(diǎn)的成套引物由序 列表中序列1所示的引物1、序列表中序列2所示的引物2、序列表中序列3所示的引物3、 序列表中序列4所示的引物4、序列表中序列5所示的引物5、序列表中序列6所示的引物 6、序列表中序列7所示的引物7和序列表中序列8所示的引物8組成。
[0007] 本發(fā)明提供的檢測(cè)待測(cè)HIV-I基因組的基因型或耐藥突變位點(diǎn)的成套引物由擴(kuò) 增引物對(duì)和測(cè)序引物組組成；
[0008] 所述擴(kuò)增引物對(duì)由序列表中序列1所示的引物1和序列表中序列2所示的引物2 組成；
[0009] 或所述擴(kuò)增引物對(duì)由序列表中序列1所示的引物1、序列表中序列2所示的引物 2、序列表中序列3所示的引物3和序列表中序列8所示的引物8組成；
[0010] 所述測(cè)序引物組由序列表中序列3所示的引物3、序列表中序列4所示的引物4、 序列表中序列5所示的引物5、序列表中序列6所示的引物6、序列表中序列7所示的引物 7和序列表中序列8所示的引物8組成。
[0011] 上述成套引物中，所述基因型為CRF01_AE亞型、B亞型、B'亞型、CRF07_BC亞型、 CRF08_BC亞型或C亞型；
[0012] 所述耐藥突變位點(diǎn)位于HIV-I基因組的Pol基因，包含蛋白酶基因區(qū)1-99位氨基 酸編碼子和逆轉(zhuǎn)錄酶基因區(qū)1-300位氨基酸編碼子；
[0013] 所述耐藥突變位點(diǎn)為 I84V、A62V、A71V、A71T、K101E、K101H、L10I、L10V、L74V、 V75M、V90I、V106M、V106I、V179D、V179E、V179D/V、Q58E、Q58E/Q、F227F/L、M184V、D67N、 G190S、G190A、T69A/T 或 T69D/N。
[0014] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種檢測(cè)Hiv-I基因組的基因型或耐藥突變位點(diǎn)的 試劑盒。
[0015] 本發(fā)明提供的檢測(cè)HIV-I基因組的基因型或耐藥突變位點(diǎn)的試劑盒為1)或2):
[0016] 1)包括上述成套引物；
[0017] 2)包括RT-PCR擴(kuò)增試劑A、RT-PCR擴(kuò)增試劑B、RT-PCR擴(kuò)增試劑C和測(cè)序擴(kuò)增試 劑組成；
[0018] 所述RT-PCR擴(kuò)增試劑A為2 X Reaction Mix溶液；
[0019] 所述RT-PCR擴(kuò)增試劑B由上述成套引物中的引物1、上述成套引物中的引物2、 dUTP 和 Dnase/Rnase-free ddH20 組成；
[0020] 所述RT-PCR擴(kuò)增試劑 C 由 Superscript'、III RT/Platinum Taq Mix 和 Antarctic Thermolabile UDG 組成；
[0021] 所述測(cè)序擴(kuò)增試劑由測(cè)序擴(kuò)增試劑I、測(cè)序擴(kuò)增試劑2、測(cè)序擴(kuò)增試劑3、測(cè)序擴(kuò)增 試劑4、測(cè)序擴(kuò)增試劑5和測(cè)序擴(kuò)增試劑6組成；
[0022] 所述測(cè)序擴(kuò)增試劑 1 是由 2.5xBigDyeK Terminator v3. IReady Reaction Mix、 緩沖液、純化水和上述成套引物中的引物3組成；
[0023] 所述測(cè)序擴(kuò)增試劑 2 是由2.5xBigDyel< Terminator v3. IReady Reaction Mix、 緩沖液、純化水和上述成套引物中的引物4組成；
[0024] 所述測(cè)序擴(kuò)增試劑 3 是由 SJxBigDye1' Terminator v3. IReady Reaction Mix、 緩沖液、純化水和上述成套引物中的引物5組成；
[0025] 所述測(cè)序擴(kuò)增試劑 4 是由 2.5xBigDyeK Terminator v3. IReady Reaction Mix、 緩沖液、純化水和上述成套引物中的引物6組成；
[0026] 所述測(cè)序擴(kuò)增試劑 5 是由 2.5xBigDyeK Terminator v3. IReady Reaction Mix、 緩沖液、純化水和上述成套引物中的引物7組成；
[0027] 所述測(cè)序擴(kuò)增試劑 6 是由 2.5xBigDyeK Terminator v3. IReady Reaction Mix、 緩沖液、純化水和上述成套引物中的引物8組成。
[0028] 上述試劑盒中，所述引物1和所述引物2的物質(zhì)的量相同；所述引物3、所述引物 4、所述引物5、所述引物6、所述引物7和所述引物8的物質(zhì)的量相同；
[0029] 所述引物1或所述引物2與所述引物3、所述引物4、所述引物5、所述引物6、所述 引物7或所述引物8的物質(zhì)的量的比為5:3. 2。
[0030] 上述試劑盒還包括PCR擴(kuò)增試劑D、PCR產(chǎn)物純化試劑、測(cè)序產(chǎn)物純化試劑1、測(cè)序 產(chǎn)物純化試劑2、陽(yáng)性對(duì)照品和陰性對(duì)照品；
[0031] 所述PCR擴(kuò)增試劑D由上述成套引物中的引物3、上述成套引物中的引物8和 Dnase/Rnase-free ddH20 組成；
[0032] 所述PCR產(chǎn)物純化試劑由熱敏磷酸酶（Antarctic Phosphatase)、外切核酸酶 I (Exonuclease I)、熱敏磷酸酶緩沖液和純化水組成；
[0033] 所述測(cè)序產(chǎn)物純化試劑1由醋酸銨和純化水組成；
[0034] 所述測(cè)序產(chǎn)物純化試劑2由純化水組成；
[0035] 所述陽(yáng)性對(duì)照品為含有Pol基因的cRNA ;所述cRNA的核苷酸序列為序列12 ;
[0036] 所述陰性對(duì)照品為 DNase/RNase-free (IdH2O0
[0037] 上述試劑盒中，所述PCR擴(kuò)增試劑D中的引物3和引物8的物質(zhì)的量相同。
[0038] 上述試劑盒中，所述基因型為CRF01_A