E亞型、B亞型、B'亞型、CRF07_BC亞型、 CRF08_BC亞型或C亞型；
[0039] 所述耐藥突變位點(diǎn)均位于HIV-I基因組的Pol基因，包含蛋白酶基因區(qū)1-99位氨 基酸編碼子和逆轉(zhuǎn)錄酶基因區(qū)1-300位氨基酸編碼子；
[0040] 所述耐藥突變位點(diǎn)為 I84V、A62V、A71V、A71T、K101E、K101H、LlOI、L10V、L74V、 V75M、V90I、V106M、V106I、V179D、V179E、V179D/V、Q58E、Q58E/Q、F227F/L、M184V、D67N、 G190S、G190A、T69A/T 或 T69D/N。
[0041] 本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供上述成套引物的用途。
[0042] 本發(fā)明提供了上述成套引物在制備檢測(cè)或輔助檢測(cè)待測(cè)HIV-I基因組的基因型 或耐藥突變位點(diǎn)的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0043] 本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供上述試劑盒的用途。
[0044] 本發(fā)明提供了上述試劑盒在制備檢測(cè)或輔助檢測(cè)待測(cè)HIV-I基因組的基因型或 耐藥突變位點(diǎn)的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0045] 本發(fā)明最后一個(gè)目的是提供一種檢測(cè)待測(cè)HIV-I基因組的基因型或耐藥突變位 點(diǎn)的方法。
[0046] 本發(fā)明提供的檢測(cè)待測(cè)HIV-I基因組的基因型或耐藥突變位點(diǎn)的方法包括如下 步驟：
[0047] 1)用上述成套引物中引物1和引物2對(duì)待測(cè)HIV-I的基因組RNA進(jìn)行一步法 RT-PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0048] 2)用上述成套引物中的引物3、引物4、引物5、引物6、引物7和引物8分別對(duì)所述 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，得到6條原始測(cè)序結(jié)果；
[0049] 3)將所述6條原始測(cè)序結(jié)果拼接后提交至本地耐藥數(shù)據(jù)庫，得到待測(cè)HIV-I基因 組的基因型及耐藥突變位點(diǎn)。
[0050] 上述方法中，所述步驟1)中，若所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)量達(dá)不到測(cè)序要求，可以所 述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，采用上述引物3和引物8再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到第二輪PCR擴(kuò)增 產(chǎn)物。
[0051] 上述方法中，所述本地耐藥數(shù)據(jù)庫由斯坦福大學(xué)HIV耐藥數(shù)據(jù)庫（HIVDB，http:// sierra2.stanford.edu/sierra/servlet/JSierra ? action = sequencelnput)、 國(guó) 際艾滋病協(xié)會(huì)數(shù)據(jù)庫（IAS, http://www. iasusa. org)、法國(guó)國(guó)家艾滋病研宄署數(shù)據(jù)庫 (ANRS, http://hivfrenchresistance. org/index. htm)和相關(guān) HIV 耐藥文獻(xiàn)報(bào)道耐藥數(shù)據(jù) 組成。
[0052] 上述方法中，所述待測(cè)HIV-I來源于離體的血漿或血清。
[0053] 上述成套引物或試劑盒或方法中，所述基因型為CRF01_AE亞型、B亞型、B'亞型、 CRF07_BC亞型、CRF08_BC亞型或C亞型；
[0054] 所述耐藥突變位點(diǎn)均位于HIV-I基因組的Pol基因，包含蛋白酶基因區(qū)1-99位氨 基酸編碼子和逆轉(zhuǎn)錄酶基因區(qū)1-300位氨基酸編碼子；
[0055] 所述耐藥突變位點(diǎn)為 I84V、A62V、A71V、A71T、K101E、K101H、LlOI、L10V、L74V、 V75M、V90I、V106M、V106I、V179D、V179E、V179D/V、Q58E、Q58E/Q、F227F/L、M184V、D67N、 G190S、G190A、T69A/T 或 T69D/N。
[0056] 上述成套引物或上述試劑盒或上述方法在鑒定HIV-I的耐藥性中的應(yīng)用也屬于 本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0057] 上述I84V耐藥位點(diǎn)位于HIV-I基因組的Pol基因的蛋白酶基因區(qū)域中，第84位 氨基酸由異亮氨酸（I)突變成纈氨酸（V);
[0058] 上述A62V耐藥位點(diǎn)位于HIV-I基因組的Pol基因的逆轉(zhuǎn)錄酶基因區(qū)域中，第62 位氨基酸由丙氨酸（A)突變成纈氨酸（V);
[0059] 上述A71V耐藥位點(diǎn)位于HIV-I基因組的Pol基因的蛋白酶基因區(qū)域中，第71位 氨基酸由丙氨酸（A)突變成纈氨酸（V);
[0060] 上述A71T耐藥位點(diǎn)位于HIV-I基因組的Pol基因的蛋白酶基因區(qū)域中，第71位 氨基酸由丙氨酸（A)突變成蘇氨酸（T);
[0061] 上述KlOlE耐藥位點(diǎn)位于HIV-I基因組的Pol基因的逆轉(zhuǎn)錄酶基因區(qū)域中，第101 位氨基酸由賴氨酸（K)突變成谷氨酸（E);
[0062] 上述KlOlH耐藥位點(diǎn)位于HIV-I基因組的Pol基因的逆轉(zhuǎn)錄酶基因區(qū)域中，第101 位氨基酸由賴氨酸（K)突變成組氨酸（H);
[0063] 上述LlOI耐藥位點(diǎn)位于HIV-I基因組的Pol基因的蛋白酶基因區(qū)域中，第10位 氨基酸由亮氨酸（L)突變成異亮氨酸（I);
[0064] 上述LlOV耐藥位點(diǎn)位于HIV-I基因組的Pol基因的蛋白酶基因區(qū)域中，第10位 氨基酸由亮氨酸（L)突變成纈氨酸（V);
[0065] 上述L74V耐藥位點(diǎn)位于HIV-I基因組的Pol基因的逆轉(zhuǎn)錄酶基因區(qū)域中，第74 位氨基酸由亮氨酸（L)突變成纈氨酸（V);
[0066] 上述V75M耐藥位點(diǎn)位于HIV-I基因組的Pol基因的逆轉(zhuǎn)錄酶基因區(qū)域中，第75 位氨基酸由纈氨酸（V)突變成甲硫氨酸（M);
[0067] 上述V90I耐藥位點(diǎn)位于HIV-I基因組的Pol基因的逆轉(zhuǎn)錄酶基因區(qū)域中，第90 位氨基酸由纈氨酸（V)突變成異亮氨酸（I);
[0068] 上述V106M耐藥位點(diǎn)位于HIV-I基因組的Pol基因的逆轉(zhuǎn)錄酶基因區(qū)域中，第106 位氨基酸由纈氨酸（V)突變成甲硫氨酸（M);
[0069] 上述V106I耐藥位點(diǎn)位于HIV-I基因組的Pol基因的逆轉(zhuǎn)錄酶基因區(qū)域中，第106 位氨基酸由纈氨酸（V)突變成異亮氨酸（I);
[0070] 上述Vl79D耐藥位點(diǎn)位于HIV-I基因組的Po 1基因的逆轉(zhuǎn)錄酶基因區(qū)域中，第179 位氨基酸由纈氨酸（V)突變成天冬門氨酸（D);
[0071] 上述V179E耐藥位點(diǎn)位于HIV-I基因組的Pol基因的逆轉(zhuǎn)錄酶基因區(qū)域中，第179 位氨基酸由纈氨酸（V)突變成谷氨酸（E);
[0072] 上述V179D/V(雜合突變）耐藥位點(diǎn)位于HIV-I基因組的Pol基因的逆轉(zhuǎn)錄酶基 因區(qū)域中，部分HIV-I病毒株第179位氨基酸由纈氨酸（V)突變成天冬門氨酸（D);
[0073] 上述Q58E耐藥位點(diǎn)位于HIV-I基因組的Pol基因的蛋白酶基因區(qū)域中，第58位 氨基酸由谷氨酰胺（Q)突變成谷氨酸（E);
[0074] 上述Q58E/Q(雜合突變）耐藥位點(diǎn)位于HIV-I基因組的Pol基因的蛋白酶基因區(qū) 域中，部分HIV-I病毒株第58位氨基酸由谷氨酰胺（Q)突變成谷氨酸（E);
[0075] 上述F227F/L(雜合突變）耐藥位點(diǎn)位于HIV-I基因組的Pol基因的逆轉(zhuǎn)錄酶基 因區(qū)域中，部分HIV-I病毒株第227位氨基酸由苯丙氨酸（F)突變成亮氨酸（L);
[0076] 上述M184V耐藥位點(diǎn)位于HIV-I基因組的Pol基因的逆轉(zhuǎn)錄酶基因區(qū)域中，第184 位氨基酸由甲硫氨酸（M)突變成纈氨酸（V);
[0077] 上述D67N耐藥位點(diǎn)位于HIV-I基因組的Pol基因的逆轉(zhuǎn)錄酶基因區(qū)域中，第67 位氨基酸由天冬門氨酸⑶突變成天冬門酰胺（N);
[0078] 上述G190S耐藥位點(diǎn)位于HIV-I基因組的Pol基因的逆轉(zhuǎn)錄酶基因區(qū)域中，第190 位氨基酸由甘氨酸（G)突變成絲氨酸（S);
[0079] 上述G190A耐藥位點(diǎn)位于HIV-I基因組的Pol基因的逆轉(zhuǎn)錄酶基因區(qū)域中，第190 位氨基酸由甘氨酸（G)突變成丙氨酸（A);
[0080] 上述T69A/T (雜合突變）耐藥位點(diǎn)位于HIV-I基因組的Pol基因的逆轉(zhuǎn)錄酶基因 區(qū)域中，部分HIV-I病毒株第69位氨基酸由蘇氨酸（T)突變成丙氨酸（A);
[0081] 上述T69D/N(混合突變）耐藥位點(diǎn)位于HIV-I基因組的Pol基因的逆轉(zhuǎn)錄酶基因 區(qū)域中，部分HIV-I病毒株第69位氨基酸由蘇氨酸（T)突變成天冬門氨酸（D)，部分HIV-I 病毒株第69位氨基酸由蘇氨酸（T)突變成天冬門酰胺（N)。
[0082] 上述HIV-I基因組的Pol基因及Pol基因編碼的氨基酸序列為現(xiàn)有技術(shù)中公開的 任一例，一個(gè)具體例子如下：Ρ〇1基因的核苷酸序列如序列表中序列10所示；所述Pol基因 編碼的氨基酸序列如序列表中序列11所示。
[0083] 本發(fā)明針對(duì)中國(guó)HIV-I流行病毒株序列的保守性特點(diǎn)，設(shè)計(jì)了覆蓋度廣、特異性 好、靈敏度高的擴(kuò)增及測(cè)序引物，提供了一種基于sanger測(cè)序法的HIV-I耐藥檢測(cè)方法，同 時(shí)也提供一種適用于國(guó)內(nèi)HIV-I耐藥檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒保證了低頻突變 毒株的檢測(cè)能力，極大地彌補(bǔ)了類似國(guó)外進(jìn)口試劑盒存在的對(duì)中國(guó)HIV流行毒株擴(kuò)增效率 差、檢出率低、低頻突變檢測(cè)率低的不足，并且具有操作簡(jiǎn)便快速、高效、經(jīng)濟(jì)、高通量等特 點(diǎn)，不僅為HIV耐藥檢測(cè)試劑國(guó)產(chǎn)化打下了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，而且為國(guó)內(nèi)大規(guī)模檢測(cè)HIV病毒株耐 藥情況開拓了廣闊的前景。
【附圖說明】
[0084] 圖1為臨床樣本RNA、陽性質(zhì)控品及陰性質(zhì)控品RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳 結(jié)果。其中，泳道1為試劑盒陽性質(zhì)控品RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果；泳道2為 臨床樣本RNA RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果；泳道3為試劑盒陰性質(zhì)控品RT-PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果；M :marker。
[0085] 圖2為試劑盒陽性質(zhì)控品擴(kuò)增產(chǎn)物雙脫氧末端終止法的測(cè)序結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0086] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0087] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0088] 實(shí)施例UHIV-I的Pol基因區(qū)的擴(kuò)增