景天根際鉛抗性菌株普羅維登斯菌,篩選方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一株從景天根際分離的鉛抗性菌株普羅維登斯菌（Providencia sp.) BPb7及其在植物-微生物聯(lián)合修復(fù)鉛重金屬污染土壤中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 土壤是人類獲取食物和其它再生資源的物質(zhì)基礎(chǔ)，是人類賴以生存的自然環(huán)境和 農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要資源。
[0003] 環(huán)境污染物的排放量與日俱增，環(huán)境污染和生態(tài)破壞給土壤帶來了嚴重的污染， 其中重金屬污染的面積在不斷增加，這不僅退化土壤肥力，降低農(nóng)產(chǎn)品的產(chǎn)量和品質(zhì)，而且 惡化水環(huán)境，并通過食物鏈危及人類的生命健康。據(jù)粗略統(tǒng)計，過去50年中全球排放到環(huán) 境中的鉛，達到7. 83 X IO5噸。目前，全球平均每天排放鉛約500萬噸，其中有相當(dāng)部分進入 了土壤，從而使部分地區(qū)的土壤遭到污染，破壞了生態(tài)系統(tǒng)的正常功能，也對人體健康造成 了危害。鉛在人體內(nèi)和蛋白質(zhì)及各種酶發(fā)生強烈的相互作用，使它們失去活性，也可能在人 體的某些器官中累積，如果超過人體所能耐受的限度，會造成人體急性中毒、亞急性中毒、 慢性中毒等危害。對重金屬污染土壤的治理和修復(fù)是一項十分緊迫的任務(wù)。
[0004] 20世紀90年代以后，許多學(xué)者注意到了植物和微生物共存體系對重金屬超積累 的重要性，植物根系-微生物系統(tǒng)的相互促進作用將是提高污染土壤生物修復(fù)能力的一個 活躍領(lǐng)域。微生物是土壤的重要組成部分，參與土壤生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)與能量轉(zhuǎn)換過程， 對提高土壤肥力和維持土壤生態(tài)平衡具有重要意義。在污染土壤中接種微生物能夠促進 植物對營養(yǎng)元素與重金屬的吸收，同時微生物能夠分泌一些生長調(diào)節(jié)劑和保護植物的抗生 素、抑菌劑和螯合劑等，這些物質(zhì)都能增強植物對環(huán)境的適應(yīng)能力。
[0005] 因此，分離具有較強鉛耐受性和促進植物修復(fù)鉛污染土壤的細菌對植物-微生物 聯(lián)合修復(fù)鉛重金屬污染土壤具有現(xiàn)實意義和重要的工程應(yīng)用價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的技術(shù)目的在于篩選景天根際具有較強鉛耐受性的細菌。
[0007] 因此，本發(fā)明的第一方面涉及一株從景天根際分離的鉛抗性菌株普羅維登斯菌 (Providencia sp.)BPb7,其于2014年12月1日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普 通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 10085。
[0008] 優(yōu)選地，所述景天根際鉛抗性菌株P(guān)rovidencia sp. BPb7的16S rDNA基因序列如 SEQ ID NO :3所示，GenBank數(shù)據(jù)庫中沒有與其一致的序列，且本菌株16S rDNA基因序列并 未提交GenBank數(shù)據(jù)庫。
[0009] 本發(fā)明的第二方面涉及上述的景天根際鉛抗性菌株P(guān)rovidencia sp. BPb7的篩選 方法，其包括步驟：
[0010] (1)選擇生長狀況良好的景天植株進行處理：取鉛（Pb)溶液母液2. 5ml，稀釋定容 至40ml，均勻澆灌在生長供試植物的土壤中，使土壤的鉛含量達到1000 mg · kg'在脅迫的 條件下繼續(xù)培養(yǎng)30d，每間隔4d澆水40ml ;
[0011] (2)菌種的分離、純化與篩選：在經(jīng)過處理的植物根際取IOg 土樣，置于90ml裝有 玻璃珠的細菌培養(yǎng)基中，在37°C恒溫振蕩器上150X g振蕩20-30min后取下，靜止5min，使 土壤沉淀；在沉淀以上的各個層面進行多次取樣，接入新的細菌培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)24h ; 取富集后的菌懸液，用倍數(shù)稀釋法將其涂布于篩選培養(yǎng)基的平板上，倒置于37°C恒溫培養(yǎng) 箱中，培養(yǎng)48h ;肉眼觀察，分別挑選不同形態(tài)的典型單菌落，在培養(yǎng)皿底做好標(biāo)記，并挑取 單菌落在新的篩選培養(yǎng)基上劃線分離；反復(fù)進行以上步驟，直至得到菌落特征一致的純菌 種；
[0012] (3)對于篩選出的已純化菌種進行保存：將分離純化得到的菌種接種于細菌培養(yǎng) 基，培養(yǎng)后加入60% (v/v)甘油，使甘油的終濃度為10% (v/v)，置于-80°C進行保存。
[0013] 其中所述細菌培養(yǎng)基為：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，蒸餾水1000mL，pH7. 0 ;
[0014] 所述篩選培養(yǎng)基的配制方法如下：基礎(chǔ)培養(yǎng)基為細菌培養(yǎng)基1000ml，添加微量元 素液和維生素液各l〇ml，121 °C滅菌20min，冷卻至70°C，加入鉛溶液母液，使培養(yǎng)基中鉛含 量為 1000 mg · L-1，37°C 培養(yǎng)。
[0015] 其中微量元素液為：MnSO4O. Olg，ZnSO40.0 5g，H3BO3O. Olg，CaCl2O. Olg，定容至 1L， 4°C避光保存；維生素液為：肌酸0. 025g，抗壞血酸0. 025g，核黃素0. 025g，檸檬酸0. 02g， 定容至1L，4°C避光保存；鉛溶液母液為：Pb (CH3COOH) 2 ·3Η20配制成Pb2+濃度為200mg ·πι1 η 的母液，過濾除菌后，室溫保存。
[0016] 本發(fā)明的第三方面涉及含有上述的景天根際鉛抗性菌株P(guān)rovidencia sp. BPb7的 組合物。
[0017] 優(yōu)選地，所述組合物具有較強的鉛耐受性。
[0018] 本發(fā)明的第四方面涉及上述的景天根際鉛抗性菌株P(guān)rovidencia sp. BPb7及所述 組合物在植物-微生物聯(lián)合修復(fù)鉛重金屬污染土壤中的用途。
[0019] 本發(fā)明的第五方面涉及上述的景天根際鉛抗性菌株P(guān)rovidencia sp. BPb7及所述 組合物在處理含重金屬鉛的污染物中的用途。優(yōu)選地，所述污染物為被污染的土壤。
[0020] 利用本發(fā)明的篩選方法從鉛脅迫的景天植物根際土壤中分離篩選出的鉛抗性菌 株P(guān)rovidencia sp.BPb7,其于2014年12月1日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普 通微生物中心，保藏地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研宄所， 保藏編號為CGMCC No. 10085;其建議的分類命名為普羅維登斯菌屬Providencia sp.;其 為革蘭氏陰性菌，需氧桿菌，無鞭毛、無莢膜。該菌株對重金屬鉛有較強的耐性，對植物-微 生物聯(lián)合修復(fù)鉛重金屬污染土壤具有現(xiàn)實意義和重要的工程應(yīng)用價值。
[0021] 本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，在本發(fā)明所獲得的上述景天根際鉛抗性菌株P(guān)rovidencia sp. BPb7新種的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對所述細菌進行適當(dāng)?shù)恼T變而繼續(xù)提高其耐 受重金屬鉛的能力，這樣的誘變后的基于本發(fā)明所述菌種的突變株也落入本發(fā)明保護的范 圍。所述誘變包括輻射、化學(xué)誘變等。同時，本領(lǐng)域技術(shù)人員也可能將本發(fā)明獲得的上述菌 株與其他植物共同使用，以達到最佳植物-微生物聯(lián)合修復(fù)重金屬鉛污染土壤的目的。
【附圖說明】
[0022] 圖 1 :菌株 Providencia sp. BPb7 的 16S rDNA 序列。
[0023] 圖2 :菌株P(guān)rovidencia sp. BPb7的透射電鏡照片。
[0024] 圖 3 :菌株 Providencia sp. BPb7 生長曲線圖。
【具體實施方式】
[0025] 下面將通過下述非限制性實施例進一步說明本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，在不 背離本發(fā)明精神的情況下，可以對本發(fā)明做出許多修改，這樣的修改也落入本發(fā)明的范圍。
[0026] 下述實驗方法如無特別說明，均為常規(guī)方法，所使用的實驗材料如無特別說明，均 可容易地從商業(yè)公司獲取。
[0027] 實施例
[0028] 實施例1景天根際鉛抗性菌株P(guān)rovidencia sp. BPb7的分離
[0029] 材料與方法
[0030] 1、培養(yǎng)基
[0031] 細菌培養(yǎng)基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，蒸餾水lOOOmL，pH7. 0。
[0032] 配制篩選培養(yǎng)基：基礎(chǔ)培養(yǎng)基為細菌培養(yǎng)基1000ml，添加微量元素液和維生素 液各10mL，121°C滅菌20min，冷卻至70°C左右，加入鉛溶液母液，使培養(yǎng)基中鉛含量為 1000 mg · ΙΛ37°C培養(yǎng)。
[0033] 其中微量元素液為：MnSO40.0 1g，ZnSO40.0 5g，H3BO30.0 1g，CaCl20.0 1g，定容至 1L， 4°C避光保存。維生素液為：肌酸0. 025g，抗壞血酸0. 025g，核黃素0. 025g，檸檬酸0. 02g， 定容至1L，4°C避光保存。鉛溶液母液：Pb (CH3COOH) 2 · 3H20配制成Pb2+濃度為200mg · mL 一1的母液，過濾除菌后，室溫保存。
[0034] 2、樣品采集和菌株分離
[0035] 選擇生長狀況良好的景天植株進行處理。取重金屬Pb溶液母液2. 5mL，稀釋定容 至40mL，均勻澆灌在供試植物的土壤中，使土壤的鉛含量達到1000 mg *kg'在脅迫的條件 下繼續(xù)培養(yǎng)30d，每間隔4d澆水40mL。在經(jīng)過處理的植物根際取IOg 土樣，置于90mL裝有 玻璃珠的細菌培養(yǎng)基中，在37°C恒溫振蕩器上150X g振蕩20-30min后取下，靜止5min，使 土壤沉淀。在沉淀以上的各個層面進行多次取樣，接入新的細菌培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)24h。取 富集培養(yǎng)后的菌懸液，用倍數(shù)稀釋法將其涂布于篩選培養(yǎng)基的平板上，倒置于37°C恒溫培 養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48h。肉眼觀察，分別挑選不同形態(tài)的典型單菌落，在培養(yǎng)皿底做好標(biāo)記，并挑 取單菌落在新的篩選培養(yǎng)基上劃線分離。反復(fù)進行以上步驟，直至得到菌落特征一致的純 菌種，至此完成菌種的分離、純化與篩選工作。對于篩選出的已純化菌種進行保存：將分離 純化得到的菌種接種于細菌培養(yǎng)基，培養(yǎng)后加入60% (v/v)甘油，使甘油的終濃度為10% (v/v)，置于_80°C進行保存。分離獲得一株對重金屬鉛有較強的耐性的細菌，命名為BPb7。
[0036] 實施例2菌株BPb7的菌種鑒定
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