、基因組DNA提取
[0038] 按照常規(guī)技術(shù)手段大量培養(yǎng)上述菌株BPb7,然后獲取其基因組DNA。
[0039] 2、菌株BPb7的16S rDNA的鑒定方法
[0040] 2. 1菌株BPb7的16S rDNA的PCR擴(kuò)增、測序及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建
[0041] 2. I. 116S rDNA基因序列的PCR擴(kuò)增
[0042] 擴(kuò)增16S rDNA基因序列的兩端引物選用通用引物：正向引物BSF8/20 : 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'（SEQ ID N0:1)和反向引物BSR1541/20: 5' -AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3' (SEQ ID NO :2)。PCR 反應(yīng)體系為 50 μ L，反應(yīng)條件為 94°C 變性51^11;接下來進(jìn)行35個循環(huán)反應(yīng)：94°0變性458,50°0退火458,72°0延伸9〇8 ;然后 72°C再延伸lOmin，最后于4°C保存。
[0043] 2. 1. 2擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆及序列測定
[0044] PCR產(chǎn)物用TAKARA公司生產(chǎn)的pMD?18-T Vector克隆試劑盒進(jìn)行克隆，先將 163扣嫩基因片段純化，連接到丨)1*|40@丨8-?。?〇1:〇1'載體上，5以1^連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化感受態(tài) 細(xì)胞DH5 α，并用菌落PCR進(jìn)行鑒定。重組子的基因序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限 公司測定。
[0045] 2. 2菌株BPb7的16S rDNA的鑒定結(jié)果
[0046] 2. 2. 1 菌株 BPb7 的 16S rDNA 基因序列
[0047] 擴(kuò)增菌株BPb7的16S rDNA基因序列，得到了長度約I. 5kb的擴(kuò)增片段。擴(kuò)增片 段經(jīng)膠回收、連接、克隆后測序，測得菌株BPb7的16S rDNA為1624bp(SEQ ID N0:3,同時 請見圖1)，該序列未提交NCBI數(shù)據(jù)庫。
[0048] 2. 2. 2BPb716S rDNA基因序列的相似性比較
[0049] 將BPb716S rDNA的序列輸入到NCBI數(shù)據(jù)庫中，運(yùn)用Blast程序?qū)⑦@株細(xì)菌的16S rDNA和數(shù)據(jù)庫中的16S rDNA基因序列進(jìn)行比對，從數(shù)據(jù)庫中挑選與BPb7的16S rDNA基因 序列具有較高相似性的菌株，見表1。
[0050] 從表 1 中可以得出，菌株 BPb7 的 16S rDNA 與和 Providencia vermicola strain FFA6、Providencia vermicola strain CICR-SPBB、Providencia vermicola strain OPl、 Enterobacteriaceae bacterium MB6-1 和 Providencia sp.XW16 菌株的相似性都比較高， 均可以達(dá)到99%以上，且多數(shù)為Providencia屬的成員。這說明菌株BPb7為Providencia vermicola的一個新亞種。
[0051] 表1菌株BPb716S rDNA序列NCBI同源性檢索結(jié)果
[0052]
[0053] 3.菌株 Providencia sp. BPb7 生理生化分析
[0054] 3. 1形態(tài)特征
[0055] 米用日本日立公司H-7650型號透射電子顯微鏡對菌株BPb7進(jìn)行了電鏡觀 察。該透射電鏡分辨率為〇. 2nm，加速電壓為40kV~120kV，放大倍率（連續(xù)放大模式 為X200~X600000 ;低倍模式為X50~X1000)。菌株BPb7的透射電鏡觀察照片見 圖2。菌株BPb7呈革蘭氏染色陰性，需氧桿菌，有菌毛、無莢膜，直徑約0. 6 μπι，長度約 L 3-1. 8 μ m，其菌落的形態(tài)特征見表2。
[0056] 表2 BPb7菌株菌落的形態(tài)特征
[0057]
[0058] 3. 2生理生化分析
[0059] 對菌株BPb7進(jìn)行了生理生化分析，其分析結(jié)果見表3。糖酵解試驗(yàn)分析結(jié)果見表 4〇
[0060] 表3 Providencia sp. BPb7的生理生化試驗(yàn)分析
[0061]
[0062；
[0063] 注：" + "陰性陰性
[0064] 表 4 Providencia sp. BPb7 的糖酵解分析
[0065]
[0066] 注：" + "表示產(chǎn)酸，"一"表示不產(chǎn)酸。
[0067] 3. 3Providencia sp. BPb7 生長曲線
[0068] 將Providencia sp. BPb7菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中活化24h，取500 μ L接種 于IOOmLLB液體培養(yǎng)基中，將三角瓶置于37°C恒溫振蕩器150 Xg進(jìn)行培養(yǎng)。每隔2h取樣 一次，以未接菌的LB液體培養(yǎng)基為空白對照，用分光光度計(jì)比色法測定600nm波長下細(xì)菌 懸浮液的吸光值，連續(xù)測定36h。以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，0D600為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)菌生長曲線 (見圖3)。
[0069] 從圖3可知，菌株BPb7從接種后4小時內(nèi)處于遲緩期，4-22小時為對數(shù)生長期，22 小時后進(jìn)入平臺期。
[0070] 4. Providencia sp. BPb7菌株促進(jìn)景天吸收重金屬鉛的能力
[0071] 通過菌劑盆栽實(shí)驗(yàn)測定菌株對植物吸收鉛的促進(jìn)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5所示。
[0072] 表5不同鉛濃度處理對景天葉片鉛含量的影響
[0073]
[0074] 從表5可以看出，在景天根部添加了 JPb5菌劑后，植株對鉛的吸收量明顯增加。在 不同的鉛處理濃度（200,400,600,800,1000mg/kg'下，投加 BPb7菌劑后，景天植物葉片鉛 含量均比未投加時高，分別提高鉛含量百分比為1. 6 %，4. 82 %，3. 66 %，4. 81 %，15. 16 %。 說明BPb7菌劑可以提高景天吸收鉛的能力。
[0075] 景天根際鉛抗性菌株或含有景天根際鉛抗性菌株的組合物在處理含重金屬鉛的 污染物或植物-微生物聯(lián)合修復(fù)鉛重金屬污染土壤中的應(yīng)用。
[0076]
[0077]
[0078]

【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一株景天根際鉛抗性菌株普羅維登斯菌（5/7.)其于2014年 12月1日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.10085。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的菌株，其特征在于其16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO: 3所示。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的景天根際鉛抗性菌株的篩選方法，其包括步驟： (1) 選擇生長狀況良好的景天植株進(jìn)行處理：取鉛（Pb)溶液母液2. 5ml，稀釋定容至 40ml，均勻澆灌在生長供試植物的土壤中，使土壤的鉛含量達(dá)到1000 mg ? kg_1;在脅迫的條 件下繼續(xù)培養(yǎng)30d，每間隔4d澆水40ml ; (2) 菌種的分離、純化與篩選：在經(jīng)過處理的植物根際取IOg 土樣，置于90ml裝有玻璃 珠的細(xì)菌培養(yǎng)基中，在37°C恒溫振蕩器上振蕩20-30min后取下，靜止5min，使土壤沉淀； 在沉淀以上的各個層面進(jìn)行多次取樣，接入新的細(xì)菌培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)24h;取富集后的 菌懸液，用倍數(shù)稀釋法將其涂布于篩選培養(yǎng)基的平板上，倒置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng) 48h;肉眼觀察，分別挑選不同形態(tài)的典型單菌落，在培養(yǎng)皿底做好標(biāo)記，并挑取單菌落在新 的篩選培養(yǎng)基上劃線分離；反復(fù)進(jìn)行以上步驟，直至得到菌落特征一致的純菌種； (3) 對于篩選出的已純化菌種進(jìn)行保存：將分離純化得到的菌種接種于細(xì)菌培養(yǎng)基，培 養(yǎng)后加入60% (v/v)甘油，使甘油的終濃度為10% (v/v)，置于-80°C進(jìn)行保存； 其中所述細(xì)菌培養(yǎng)基為：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，蒸餾水lOOOmL，pH7. 0 ; 所述篩選培養(yǎng)基的配制方法如下：取所述細(xì)菌培養(yǎng)基l〇〇〇ml，添加微量元素液和維 生素液各l〇ml，121°C滅菌20min，冷卻至70°C，加入鉛溶液母液，使培養(yǎng)基中鉛含量為 1000 mg ? L'37°C培養(yǎng)； 其中所述微量元素液為：MnSO4 0? 01g，ZnSO4 0? 05g，H3BO3 0? 01g，CaCl2 0? 01g，定 容至1L，4°C避光保存；所述維生素液為：肌酸0. 025g，抗壞血酸0. 025g，核黃素0. 025g， 檸檬酸0. 02g，定容至1L，4°C避光保存；所述鉛溶液母液為：Pb(CH3COOH)2 ? 3H20配制成 Pb2+濃度為200mg ? ml 的母液，過濾除菌后，室溫保存。4. 一種含有權(quán)利要求1或2所述的景天根際鉛抗性菌株的組合物。5. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的景天根際鉛抗性菌株或權(quán)利要求4所述組合物在處理含 重金屬鉛的污染物或植物-微生物聯(lián)合修復(fù)鉛重金屬污染土壤中的用途。
【專利摘要】本發(fā)明涉及景天根際鉛抗性菌株普羅維登斯菌（Providencia sp.）BPb7。具體而言，本發(fā)明涉及一株從景天根際分離的鉛抗性菌株P(guān)rovidencia sp.BPb7，其于2014年12月1日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCC No.10085。其為革蘭氏陰性菌，需氧桿菌，有菌毛、無莢膜。該菌株對重金屬鉛有較強(qiáng)的耐性，對植物-微生物聯(lián)合修復(fù)鉛重金屬污染土壤具有現(xiàn)實(shí)意義和重要的工程應(yīng)用價值。CGMCC No.1008520141201
【IPC分類】C12N1/20, B09C1/10, C12R1/01
【公開號】CN104974959
【申請?zhí)枴緾N201510397878
【發(fā)明人】林海龍, 范陽, 馮晶石, 田宇哲, 李德斌
【申請人】中國長江三峽集團(tuán)公司, 中國水利電力對外公司
【公開日】2015年10月14日
【申請日】2015年7月8日