一種加速聚合酶螺旋反應(yīng)的方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種加速聚合酶螺旋反應(yīng)的方法及其 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction)，即PCR技術(shù)，是美國Cetus公司 人類遺傳研宄室的科學(xué)家K. B. Mullis于1983年發(fā)明的一種在體外快速擴增特定基因或 DNA序列的方法，特點是利用耐熱的DNA聚合酶，將引物和目標(biāo)DNA混合，經(jīng)過高溫變性、低 溫退火和適溫延伸3個過程為一個周期進行循環(huán)，將目標(biāo)DNA在短時間內(nèi)得到大量擴增。 PCR技術(shù)具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡便、重復(fù)性好、易自動化等突出的優(yōu)點；能在一個 試管內(nèi)將所要研宄的目的基因或某一 DNA片段于數(shù)小時內(nèi)擴增至十萬乃至百萬倍，使肉眼 能直接觀察和判斷；可從一根毛發(fā)、一滴血、甚至一個細(xì)胞中擴增出足量的DNA供分析研宄 和檢測鑒定。PCR技術(shù)是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的一項革命性創(chuàng)舉和里程碑，但PCR技術(shù)一直無法 擺脫熱循環(huán)的限制，經(jīng)過幾十年技術(shù)的發(fā)展，一些恒溫核酸擴增技術(shù)逐漸被發(fā)明出來。
[0003] 核酸恒溫擴增技術(shù)是指在溫度不變的情況下將目標(biāo)基因大量復(fù)制的技術(shù)，核酸恒 溫擴增方法目前主要包括以下幾種：
[0004] TAS，即轉(zhuǎn)錄依賴的擴增系統(tǒng)（Transcript-based Amplification System)，是美 國SISKA診斷研宄所和Salk研宄所于1989年共同研發(fā)的，主要應(yīng)用于RNA的擴增，它的反 應(yīng)原理是在逆轉(zhuǎn)錄酶和T7RNA多聚酶的作用下將目標(biāo)RNA通過階梯式溫度變化而大量擴增 出來，在擴增過程中也主要依靠了逆轉(zhuǎn)錄酶的多聚酶活性和RNase H的活性，這種擴增方式 擺脫了高熱循環(huán)的限制，只需要將溫度進行階梯設(shè)置，具有重大的進步意義，且具有很高的 特異性和敏感性，但在反應(yīng)的過程中需要不斷的添加逆轉(zhuǎn)錄酶和T7RNA多聚酶，使用時帶 來很多不方便，而且目前只能擴增RNA。
[0005] NASBA，即依賴于核酸序列的擴增（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification)，在1991年，由加拿大Can-gene公司最先發(fā)表論文介紹，NASBA是一種等 溫擴增技術(shù)，它能在體外將核酸序列進行大量復(fù)制，是由兩個引物介導(dǎo)的、穩(wěn)定持續(xù)的酶促 反應(yīng)。NASBA反應(yīng)要依賴AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNase H、T7 RNA聚合酶，整個反應(yīng)在恒溫（41 °C ) 條件下進行的，I. 5-2h即可得到理想的結(jié)果。NASBA的缺點為：在產(chǎn)物檢測上仍需要復(fù)雜的 后續(xù)程序；酶非耐熱性，且要在RNA鏈溶解之后才能加入；低溫容易導(dǎo)致引物的非特異性相 互作用從而造成非特異性擴增；反應(yīng)需要加入三種酶，且需要三種酶在同一溫度、同一反應(yīng) 體系下被激活。
[0006] 3SR，即自主序列復(fù)制（Self-Sustained Sequence Replication)，也是由美國 SISKA診斷研宄所和Salk研宄所在TAS基礎(chǔ)上研發(fā)而來，原理同TAS基本相似，只不過多了 RNase H酶，同時其反應(yīng)也必需AMV逆轉(zhuǎn)錄酶和T7RNA多聚酶。相比NASBA，3SR比較復(fù)雜， 敏感性不強。NASBA正逐漸取代3SR。
[0007] SDA，即鏈替代擴增（Strand Displacement Amplification)，是 1992 年由美國學(xué) 者Wallker等人建立，它利用限制性內(nèi)切核酸酶剪切DNA識別位點的能力和DNA聚合酶在 缺口處向3'延伸并置換下游序列的能力，在等溫條件下將目標(biāo)序列大量擴增出來。SDA的 缺點是仍需要變性的過程，擴增的靶序列不能超過200bp，后續(xù)檢測復(fù)雜。
[0008] RCA，即滾環(huán)擴增（Rolling Circle Amplification)，于 1998 年被發(fā)明出來。該方 法靈感主要來自自然界微生物環(huán)狀DNA的復(fù)制過程，通過體外模擬這種環(huán)狀DNA的擴增而 發(fā)明的，主要通過巧妙的引物設(shè)計和在DNA聚合酶的作用下將靶序列大量擴增出來，但其 擴增產(chǎn)物非常復(fù)雜，且片段大小不一。由于RCA只能擴增環(huán)狀的DNA模板，所以大大限制了 其的應(yīng)用范圍。
[0009] HDA，即依賴解旋酶基因擴增（Helicase-Dependent Amplification)，是由美國 New England Biolabs公司的科研人員Vincent等在2004年首次介紹的一種恒溫體外核酸 擴增技術(shù)，它的反應(yīng)原理是在解旋酶的作用下將雙鏈DNA打開，再依靠單鏈DNA結(jié)合蛋白與 模板單鏈結(jié)合，這樣就可以使DNA保持單鏈的狀態(tài)，然后引物與單鏈結(jié)合，在DNA聚合酶的 作用下向前延伸。但是，HDA擴增也需要三種酶，因而大大限制了其的應(yīng)用范圍。
[0010] SPIA，即單引物等溫擴增技術(shù)（Single Primer Isothermal Amplification)， 2005年被發(fā)明出來。該技術(shù)主要通過一條3'端是DNA片段、5'端是RNA片段的混合物， 在RNase H及具有強鏈置換活性的DNA聚合酶作用下，單鏈的cDNA便被大量的擴增出來。 SPIA擴增的溫度在60°C左右，在半個小時內(nèi)完成。SPIA擴增技術(shù)具有擴增效率高、保守性 強、原理簡單等優(yōu)點，適用于核酸檢測、核酸測序、SNP檢測、單鏈模板制備以及基因芯片探 針制備等方面。
[0011] 2000年，Notomi等人建立的一種新的體外核酸擴增技術(shù)，即環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增技術(shù) (Loop-mediated Isothermal Amplification，簡稱LAMP)，這種新穎的擴增方法需要至少 4條引物，最多6條引物來特異性識別目標(biāo)片段的6個、7個或者8個區(qū)域，在DNA聚合酶 的鏈置換作用下可以在很短的時間內(nèi)將靶序列擴增出來，具有簡單、特異、高效、迅速的特 點，大量合成目標(biāo)DNA的同時伴隨有副產(chǎn)物的產(chǎn)生，即白色的焦磷酸鎂沉淀，這一特性可以 使LAMP反應(yīng)通過濁度變化來直接判斷陰、陽性結(jié)果。PCR需要兩條引物來特異性結(jié)合靶序 列的兩個區(qū)間，而LAMP則是特異性的結(jié)合6至8個區(qū)間，所以相較于PCR，具有很強的特異 性；敏感性比普通PCR可以提高10-100倍，與熒光定量PCR的敏感性相當(dāng)，而且LAMP擴增 的過程是在恒溫條件下進行的，有熱穩(wěn)定的設(shè)備（比如恒溫水浴鍋、恒溫金屬浴等）就能滿 足反應(yīng)要求，因次大大降低了檢測成本。自從LAMP技術(shù)被報道后，在短短的十幾年的時間 里，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、真菌、病毒等微生物的檢測，遺傳病的診斷，以及性別的早期判 定等領(lǐng)域。
[0012] 各種恒溫擴增技術(shù)的比較結(jié)果詳見表1。
[0013] 表1恒溫擴增技術(shù)的比較結(jié)果
[0014]
[0015] *注：PubMed表示以各種恒溫擴增技術(shù)的英文全稱在PubMed所能檢索到的文章 數(shù)，截止到2014年3月25日。
[0016] 這些恒溫核酸擴增方法中最有優(yōu)勢的是LAMP法，但LAMP產(chǎn)物過于復(fù)雜，且LAMP 產(chǎn)物的回收測序很困難，不能像普通PCR產(chǎn)物一樣直接測序；由于LAMP產(chǎn)物是極其復(fù)雜的 不規(guī)則的擴增混合物，因此LAMP產(chǎn)物不可以用來克隆。這些缺點使LAMP的應(yīng)用只局限在 基因的快速檢測方面。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0017] 本發(fā)明的一個目的是提供用于擴增靶序列的聚合酶螺旋反應(yīng)恒溫擴增核酸的引 物。
[0018] 本發(fā)明提供的用于擴增靶序列的聚合酶螺旋反應(yīng)恒溫擴增核酸的引物，包括特異 引物對和P對加速引物對A ;
[0019] 所述特異引物對由引物FP和引物BP組成，將所述特異引物的靶序列命名為靶序 列甲；
[0020] 所述引物FP從5'端至3'端依次由N區(qū)域和F區(qū)域組成，所述F區(qū)域與所述靶序 列甲3'末端起15-30bp核苷酸相同或互補；
[0021] 所述引物BP從5'端至3'端依次由Ν'區(qū)域和B區(qū)域組成，所述B區(qū)域與所述靶 序列甲5'末端起15-30bp核苷酸互補或相同；
[0022] 所述Ν'區(qū)域為N區(qū)域的反向不互補序列。N不與F區(qū)域相同或互補；N'不與B區(qū) 域相同或互補。
[0023] 每個所述加速引物對A的靶序列為所述靶序列甲中的某個區(qū)段，將其命名