為靶區(qū) 段乙，且每對(duì)加速引物對(duì)A中的上游引物和下游引物均不與所述F區(qū)域或所述B區(qū)域重疊， P為大于等于1的整數(shù)。
[0024] 上述加速引物對(duì)A中的上游引物與所述靶區(qū)段乙自3'端15_30bp核苷酸相同或互 補(bǔ)，所述加速引物對(duì)A中的下游引物與所述靶區(qū)段乙自5'端15-30bp核苷酸互補(bǔ)或相同。
[0025] 上述引物還包括m個(gè)加速引物對(duì)B ;每個(gè)所述加速引物對(duì)B的靶序列命名為靶片 段丙，其為所述靶序列甲中的某個(gè)區(qū)段；
[0026] 所述加速引物對(duì)B的上游引物從5'端至3'端依次由Nl區(qū)域和B-I區(qū)域組成，所 述B-I區(qū)域與所述靶片段丙3'端15-30bp核苷酸相同或互補(bǔ)；所述B-I區(qū)域不與所述F區(qū) 域或所述B區(qū)域重疊；
[0027] 所述加速引物對(duì)B的下游引物從5'端至3'端依次由ΝΓ區(qū)域和B-2區(qū)域組成， 所述B-2區(qū)域與所述靶片段丙5'端起15-30bp核苷酸互補(bǔ)或相同；所述B-2區(qū)域不與所述 F區(qū)域或所述B區(qū)域重疊；
[0028] Nl不與B-I區(qū)域相同或互補(bǔ)；ΝΓ不與B-2區(qū)域相同或互補(bǔ)。
[0029] 所述ΝΓ區(qū)域?yàn)镹l區(qū)域的反向不互補(bǔ)序列；
[0030] 所述靶片段丙和所述靶片段乙相同或不同；
[0031] m為大于等于1的整數(shù)。
[0032] 上述引物為如下：
[0033] 1)特異引物
[0034] 2)特異引物和p個(gè)加速引物A ;
[0035] 3)特異引物和m個(gè)加速引物B ;
[0036] 4)特異引物、p個(gè)加速引物A和m個(gè)加速引物B ;且所述加速引物A的靶片段乙和 所述加速引物B的靶片段丙不同。
[0037] 所述靶序列甲從5'端至3'端包括Bc區(qū)域、Bcl區(qū)域、……、Bcn-Ι區(qū)域、Bcn區(qū) 域、Fcn區(qū)域、Fcn-I區(qū)域、......、Fcl區(qū)域、Fc區(qū)域；
[0038] η大于等于2。
[0039] 所述引物FP從5'端至3'端依次由N區(qū)域和F區(qū)域組成，F(xiàn)區(qū)域與靶序列上3'末 端的Fc區(qū)域（靶序列甲3'末端起15-30bp核苷酸）相同或互補(bǔ)；
[0040] 所述引物BP從5'端至3'端依次由Ν'區(qū)域和B區(qū)域，B區(qū)域與靶序列上5'末端 的Bc區(qū)域（靶序列甲5'末端起15-30bp核苷酸）互補(bǔ)或相同；Ν'區(qū)域?yàn)镹區(qū)域的反向不 互補(bǔ)序列；
[0041] 所述靶序列BC和FC區(qū)域之間的靠近FC區(qū)域的任一區(qū)域（靶區(qū)段乙上靠近3'端 的部分）為Fcn區(qū)域、Fcn-I區(qū)域、......、Fcl區(qū)域；
[0042] 所述靶序列BC和FC區(qū)域之間的靠近BC區(qū)域的任一區(qū)域（靶區(qū)段乙上靠近5'端 的部分）為Bcl區(qū)域、......、Bcn-I區(qū)域、Bcn區(qū)域；
[0043] 所述B-I區(qū)域與靶序列BC和FC區(qū)域之間的靠近FC區(qū)域的任一區(qū)域（靶區(qū)段丙 上靠近3'端的部分）相同或互補(bǔ)；
[0044] 所述B-2區(qū)域與靶序列BC和FC區(qū)域之間的靠近BC區(qū)域的任一區(qū)域（靶區(qū)段丙 上靠近5'端的部分）互補(bǔ)或相同；
[0045] m為大于等于1的整數(shù)。
[0046] 上述引物中，所述靶序列為序列表中序列1 ;
[0047] 所述引物由特異引物對(duì)和1個(gè)加速引物A對(duì)組成；
[0048] 所述特異引物對(duì)中的引物FP的核苷酸序列為序列2 ;
[0049] 所述特異引物對(duì)中的引物BP的核苷酸序列為序列3 ;
[0050] 所述加速引物A中的引物^\±的核苷酸序列為序列7 ;
[0051] 所述加速引物A中的引物At的核苷酸序列為序列8。
[0052] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于擴(kuò)增靶序列的聚合酶螺旋反應(yīng)恒溫?cái)U(kuò)增核酸的 試劑。
[0053] 本發(fā)明提供的試劑，包括上述引物、Tris · HC1、KC1、（NH4)2S04、Tween20、甜菜堿、 MgS04、dNTPs 和 DNA 聚合酶；
[0054] 在所述試劑中，所述引物中各條引物的摩爾比均為等比例。
[0055] 上述試劑還包括逆轉(zhuǎn)錄酶。
[0056] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供用于擴(kuò)增靶序列的聚合酶螺旋反應(yīng)恒溫?cái)U(kuò)增核酸的 試劑盒。
[0057] 本發(fā)明提供的試劑盒，包括上述的引物或上述的試劑。
[0058] 上述的引物或上述的試劑或上述的試劑盒在檢測(cè)待測(cè)樣品中是否含有目的核酸 分子中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0059] 或上述的引物或上述的試劑或上述的試劑盒在制備檢測(cè)待測(cè)樣品中是否含有目 的核酸分子產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0060] 本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種檢測(cè)待測(cè)樣品中是否含有目的核酸分子的方法。
[0061 ] 本發(fā)明提供的方法，為A或B :
[0062] A包括如下步驟：
[0063] 1)提取待測(cè)樣品中的核酸；
[0064] 2)以所述核酸為模板用上述的試劑擴(kuò)增，得到擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物；
[0065] 3)用實(shí)時(shí)濁度儀檢測(cè)所述擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物，若所述擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物的實(shí)時(shí)濁度檢測(cè)曲 線(xiàn)上升，則所述待測(cè)樣本含有或候選含有所述目的核酸分子；
[0066] 若所述擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物的實(shí)時(shí)濁度檢測(cè)曲線(xiàn)沒(méi)有上升，則所述待測(cè)樣本不含有或候 選不含有所述目的核酸分子；
[0067] B包括如下步驟：
[0068] 1)提取待測(cè)樣品中的核酸；
[0069] 2)以所述核酸為模板用上述的試劑擴(kuò)增，且擴(kuò)增時(shí)加入顯色劑，得到擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn) 物；
[0070] 3)肉眼觀察所述擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物，若所述擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物顯色，則所述待測(cè)樣本含有 或候選含有所述目的核酸分子；
[0071] 若所述擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物不顯色，則所述待測(cè)樣本不含有或候選不含有所述目的核酸 分子。
[0072] 上述方法中，所述擴(kuò)增的條件為60-65°C恒溫反應(yīng)120-150min。
[0073] 上述方法中，所述核酸為DNA或RNA。
[0074] 上述封閉劑（專(zhuān)利【申請(qǐng)?zhí)枴?01210371448. 5)為熔點(diǎn)低于核酸恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)溫度 0-25°C、直徑與反應(yīng)管管徑相同的柱狀全精煉固態(tài)石蠟塊或半精煉固態(tài)石蠟塊，封閉劑的 使用方法為：將石蠟塊加入到反應(yīng)管中反應(yīng)液的上方，蓋上蓋，進(jìn)行反應(yīng)。
[0075] 本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明提供了一種恒溫?cái)U(kuò)增核酸的新方法及其專(zhuān)用引物，將 其命名為聚合酶螺旋反應(yīng)（Polymerase Spiral Reaction，PSR)，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0076] 1、擴(kuò)增反應(yīng)可在恒溫環(huán)境下進(jìn)行，這使得一個(gè)水浴鍋或者恒溫金屬浴就可以滿(mǎn)足 實(shí)驗(yàn)要求；
[0077] 2、引物設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，只需要一對(duì)引物即可完成核酸的擴(kuò)增，若添加一對(duì)加速引物，反 應(yīng)時(shí)間則大大縮短；PSR用戶(hù)使用普通的PCR引物設(shè)計(jì)軟件（如Primer5、DNAMAN等）即可 完成引物的設(shè)計(jì)，只需在PCR引物5'端添加一對(duì)通用的外源基因（N)即可完成等溫?cái)U(kuò)增反 應(yīng)；
[0078] 3、敏感性高，適用于病毒等核酸含量低的樣本的檢測(cè)；
[0079] 4、高效擴(kuò)增，擴(kuò)增DNA量能達(dá)到0· 6 μ g/ μ L ;
[0080] 5、操作簡(jiǎn)單，通過(guò)實(shí)時(shí)濁度儀或者鈣黃綠素/Mn2+顯色液即可肉眼觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果；
[0081] 6、待擴(kuò)增的目的片段大小可變性廣，從IOObp至200bp均能完成擴(kuò)增。
[0082] 7、在添加了加速引物后可以使反應(yīng)時(shí)間大大縮短。
[0083] 綜上所述，本發(fā)明為核酸檢測(cè)提供了新的技術(shù)平臺(tái)，擴(kuò)增產(chǎn)物比較簡(jiǎn)單，不僅可以 應(yīng)用在檢測(cè)領(lǐng)域，還可以再稍加處理后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆回收和測(cè)序，該方法可以應(yīng)用 在所有需要核酸擴(kuò)增的領(lǐng)域，具有廣闊的市場(chǎng)前景和較大的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)效益，適于大范圍推 廣應(yīng)用。
[0084] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
【附圖說(shuō)明】
[0085] 圖1為自螺旋等溫鏈?zhǔn)椒磻?yīng)加速引物示意圖。
[0086] 圖2為自螺旋等溫鏈?zhǔn)椒磻?yīng)幾種引物組合方式示意圖。
[0087] 圖3為