小rna組成的指紋圖譜在人卵巢癌診斷和治療中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明公開了一種小RNA(miRNA ;microRNA)指紋圖譜在卵巢癌診斷中的用途，屬 于生物醫(yī)學(xué)、生物工程和檢測技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 卵巢惡性腫瘤是女性生殖器官常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率僅次于子宮頸癌和子 宮體癌而列居第三位（Jemal等人；2011)。但卵巢上皮癌死亡率卻占各類婦科腫瘤的首位， 對(duì)婦女生命造成嚴(yán)重威脅。由于卵巢的胚胎發(fā)育、組織解剖及內(nèi)分泌功能較復(fù)雜，早期癥 狀不典型，術(shù)前鑒別卵巢腫瘤的組織類型及良惡性相當(dāng)困難。卵巢惡性腫瘤中以上皮癌最 多見，約占卵巢癌的80%-90%(Chan等人；2006)，其次是惡性生殖細(xì)胞腫瘤。卵巢上皮癌患 者手術(shù)中發(fā)現(xiàn)腫瘤局限于卵巢的僅占30%，大多數(shù)已擴(kuò)散到子宮，大網(wǎng)膜及盆腔各器官。由 于卵巢癌的早期癥狀不明顯，鑒別其腫瘤良性、惡性很困難，只有20%的患者能夠在進(jìn)行早 期診斷出來，而近80%的患者就診時(shí)已屬晚期（Ahmed等人；1996、Etzioni等人；2003和 Wright 等人；2009)。
[0003] 在卵巢癌早期診斷中，CA-125是目前研究最深入、應(yīng)用最廣泛的血清腫瘤標(biāo)志物， 也是普遍使用的早期診斷工具之一，但是此標(biāo)志物特異性差，而且只能檢測30%的早期卵 巢癌患者，所以早期診斷依然是卵巢癌的一大難題（Menon等人；2012)。
[0004] 近年來不斷有文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iRNA在腫瘤診斷和治療中的作用，卵巢癌特異性miRNA 的發(fā)現(xiàn)為其診斷和治療打開了一個(gè)全新的局面。miRNA是一類內(nèi)源性小分子非編碼RNA，結(jié) 構(gòu)高度保守，具有表達(dá)時(shí)序性和組織特異性，通過與靶基因3'非編碼區(qū)（3'UTR)互補(bǔ)序列 特異性結(jié)合，導(dǎo)致翻譯抑制或者mRNA降解，從而調(diào)芐基因表達(dá)（Bartel ;2004和Huang等 人；2010)。miRNA在惡性腫瘤中表達(dá)譜各異并發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，隨著大規(guī)模、高通量 miRNA檢測技術(shù)的推廣應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)新的miRNA不僅為腫瘤的診斷和預(yù)后提供了頗具價(jià)值的 標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)也為尋找新的腫瘤生物治療祀標(biāo)奠定了基礎(chǔ)（Mezzanzanica等人；2010)。
[0005] miRNA的表達(dá)水平和腫瘤細(xì)胞的分化程度密切相關(guān)，而常規(guī)的mRNA標(biāo)志物不具備 此特點(diǎn)。Bendoraite等人通過qPCR定量卵巢癌細(xì)胞中miR-200家族的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與在其余 癌癥中報(bào)道的miR-200家族明顯低表達(dá)不同，在卵巢癌細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)趨勢，通過軟件 預(yù)測和3' UTR熒光素酶報(bào)告法發(fā)現(xiàn)其靶標(biāo)為ZEBl和ZEB2,且進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在卵巢癌發(fā)展 模式中，卵巢表皮細(xì)胞是先從間質(zhì)到上皮的轉(zhuǎn)移，這點(diǎn)也是與其他癌癥是先從上皮轉(zhuǎn)移到 間質(zhì)過程相反（Bendoraite等人；2010)。ZEB轉(zhuǎn)錄因子是BMP信號(hào)通路的關(guān)鍵阻遏，Peart 等人發(fā)現(xiàn)BMP信號(hào)通路通過調(diào)節(jié)AKT酶的活性從而達(dá)到調(diào)控腹水誘導(dǎo)的人類卵巢表皮癌的 惡性程度（Peart等人；2012)。Li等人通過對(duì)人類轉(zhuǎn)移性漿液性卵巢癌細(xì)胞SK0V-3ip和低 轉(zhuǎn)移人漿液性卵巢癌細(xì)胞SK0V-3做miRNA表達(dá)譜芯片和熒光定量PCR驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)有多條差 異表達(dá)的miRNA，特別是miR-22對(duì)卵巢癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲有抑制作用（Li等人；2012)。 Xu等人還發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-182和miR-96靶標(biāo)作用于FHB 03,對(duì)于調(diào)控卵巢癌細(xì)胞的增殖 起著顯著作用（Xu等人；2013)。Wang和他的團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)miR-182直接祀標(biāo)負(fù)調(diào)節(jié)作用于卵 巢癌的腫瘤抑制子F1D⑶4 (Wang等人；2013)。Li等人的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-183負(fù)調(diào)節(jié) Tiaml的表達(dá)，從而促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的遷移，侵襲和生長（Li等人；2012)。Stark等研究表 明，miRNA可以調(diào)節(jié)腫瘤形成，而且暗示其中的某些簇（如miR-17-92)可能是潛在的人類 原癌基因（Stark等人；2010)。
[0006] 上述這些發(fā)現(xiàn)可能會(huì)給藥物設(shè)計(jì)和針對(duì)性治療提供一個(gè)新的平臺(tái)。而血清作 為腫瘤生物標(biāo)記物，也是研究的熱點(diǎn)。Li等人在2011年發(fā)現(xiàn)血清miRNA不受RNase、 環(huán)境、pH和低溫影響的高度穩(wěn)定性也使得腫瘤患者的實(shí)際值與實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果大致一致 (Li等人；2012)。miR-21是最早發(fā)現(xiàn)的血清miRNA生物標(biāo)記物。Taylor等人比較了良 性卵巢腫瘤血清和不同臨床分期卵巢癌血清的外周血小體中miRNA表達(dá)譜。研究發(fā)現(xiàn)： miR-200, miR-21，miR-141等8條miRNA高表達(dá)，而在正常對(duì)照人群中未檢測到其差異表達(dá) (Taylor等人；2008)。因此，在外周血中這8條目標(biāo)miRNA作為對(duì)無明顯癥狀的卵巢癌患 者進(jìn)行篩選，作為潛在的生物標(biāo)記物。Resnick等人通過TaqMan?芯片法發(fā)現(xiàn)卵巢癌病人血 清中，21條差異表達(dá)的miRNA，進(jìn)一步通過文獻(xiàn)和定量結(jié)果發(fā)現(xiàn):miR-21，miR-92，miR-29a， miR-126相對(duì)于在正常樣本中而目，在卵巢癌血清中是顯著1?表達(dá)的，而miR-155， miR-127，miR-99b則顯著低表達(dá)，且還發(fā)現(xiàn)miR-21，miR-92，miR-93在生化指標(biāo)CA125正常 的卵巢癌患者中顯著高表達(dá)，反映了 miRNA可作為卵巢癌診斷的潛在生物標(biāo)記物（Resnick 等人；2009)。
[0007] 盡管大量關(guān)于卵巢癌治療的研究，卵巢癌仍難于診斷和有效治療，患者中觀測到 的死亡率表明疾病的診斷、治療和預(yù)防需要改進(jìn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于提供有效的小RNA指紋圖譜，用于卵巢癌診斷、腫瘤分級(jí)和預(yù) 后評(píng)價(jià)。
[0009] 本發(fā)明的第一方面，提供一種分離的miRNA，所述的miRNA為：
[0010] ( i )序列如SEQ ID Ν0:η所示的miRNA，其中η為選自1-3的正整數(shù)；
[0011] ( ii )與 SEQ ID NO:η 所示序列互補(bǔ)的 miRNA ;
[0012] ( iii )序列如SEQ ID NO: 1-3所示的miRNA中的兩種或兩種以上的組合；或
[0013] ( iv )與SEQ ID NO: 1-3所示序列互補(bǔ)的miRNA中的兩種或兩種以上的組合。
[0014] 本發(fā)明的第二方面，提供一種miRNA集合或組合，所述miRNA集合或組合包含序列 如 SEQ ID NO: 1-3 所示的 3 種 miRNA。
[0015] 在另一優(yōu)選例中，所述miRNA集合或組合由序列如SEQ ID N0:l-6所示的6種 miRNA所構(gòu)成。
[0016] 在另一優(yōu)選例中，所述miRNA集合或組合由序列如SEQ ID N0:l-10所示的10種 miRNA所構(gòu)成。
[0017] 在另一優(yōu)選例中，所述miRNA集合或組合為由十個(gè)小RNA (HSA-MIR-1271-5P、 HSA-MIR-574-3P、HSA-MIR-182-5P、HSA-MIR-183-5P、HSA-MIR-96-5P、HSA-MIR-15B-5P、 HSA-MIR-182-3P、HSA-MIR-141-5P、HSA-MIR-130B-5P 和 HSA-MIR-135B-3P)組成的小 RNA 指紋圖譜，用于卵巢癌診斷、腫瘤分級(jí)和預(yù)后評(píng)價(jià)。
[0018] 在另一優(yōu)選例中，所述miRNA集合或組合由序列如SEQ ID NO: 1-6和SEQ IDN0:11 所示的7種miRNA所構(gòu)成。
[0019] 在另一優(yōu)選例中，所述miRNA集合或組合為由七個(gè)小RNA (hsa-miR-182-5p、 hsa-miR-183-5p、hsa-miR-96-5p、hsa-miR-1271-5p、hsa-miR-182-3p、hsa-miR-1468-5p 和 hsa-miR-135b-3p)組成的小RNA指紋圖譜，用于上皮性卵巢癌診斷、腫瘤分級(jí)和預(yù)后評(píng)價(jià)。
[0020] 在另一優(yōu)選例中，所述的miRNA分離自人。
[0021] 在另一優(yōu)選例中，所述的序列可通過化學(xué)合成或構(gòu)建真核細(xì)胞表達(dá)載體進(jìn)行表達(dá) 獲得。
[0022] 在另一優(yōu)選例中，所述miRNA集合或組合還包含序列如SEQ ID NO: 12-516所示的 miRNA中的兩種或兩種以上的組合。
[0023] 在另一優(yōu)選例中，所述的miRNA集合或組合包括HSA-MIR-1271-5P、 HSA-MIR-574-3P、HSA-MIR-182-5P、HSA-MIR-183-5P、HSA-MIR-96-5P、HSA-MIR-15B-5P、 HSA-MIR-182-3P、HSA-MIR-141-5P、HSA-MIR-130B-5P 和 HSA-MIR-135B-3P 中的一種或兩種 以上，用于區(qū)分卵巢癌組織和正常卵巢組織。
[0024] 在另一優(yōu)選例中，HSA-MIR-1271-5P和HSA-MIR-574-3P在卵巢癌組織中表達(dá)下 調(diào)。
[0025] 在另一優(yōu)選例中，所述的miRNA集合或組合包括hsa-miR-182_5p、 hsa-miR-183-5p、hsa-miR-96-5p、hsa-miR-1271-5p、hsa-miR-182-3p、hsa-miR-1468-5p 和 hsa-miR-135b-3p中的一種或兩種以上，用于區(qū)分上皮性卵巢癌組織和正常卵巢組織。
[0026] 在另一優(yōu)選例中，HSA-MIR-182-5P、HSA-MIR-183-5P、HSA-MIR-96-5P、 HSA-MIR-15B-5P、HSA-MIR-182-3P、HSA-MIR-141-5P、HSA-MIR-130B-5P 和 HSA-MIR-135B-3P 在卵巢癌組織中表達(dá)上調(diào)。
[0027] 在另一優(yōu)選例中，所述的miRNA集合或組合包括425種在卵巢癌組織和正常卵 巢組織中表達(dá)倍數(shù)差異大于2的miRNA，其中204種上調(diào)（hsa-miR-522、hsa-miR-429、 hsa-miR-141_5P、hsa_miR-200a、hsa-miR-96_5P、hsa-miR-183_5P、hsa_miR-449c、 hsa-miR-205 和 hsa-miR-182-5P 最顯著，差異倍數(shù)大于 10) ;221 種下調(diào)（hsa-miR-202-3p、 hsa-miR-4711-3p、hsa-miR-4778-5p、hsa-miR-4510、hsa-miR-4789-5p、hsa-miR-4760-3p、 hsa-miR-4804_5p，hsa-miR-4770、hsa-miR-4781_3p、hsa-miR-4738_5p、hsa-miR-4777_5p、 hsa-miR-4696和hsa-miR-4678最顯著，差異倍數(shù)大于10);由此區(qū)分卵巢癌組織和正常卵 巢組織。
[0028] 在另一優(yōu)選例中，所述的miRNA集合或組合包括489種在上皮性卵巢癌組 織和正常卵巢組織中表達(dá)倍數(shù)差異大于2的miRNA，其中241種上調(diào)（hsa-miR-522、 hsa-miR-429、 hsa-miR-96_5P、 hsa-miR-205、 hsa-miR-141_5P、 hsa-miR-183_5P、 hsa_miR-200a、 hsa-miR-182_5P、 hsa_miR-519a、 hsa_miR-200c、 hsa_miR-449c、 hsa-miR-182_3p、hsa-miR-135b_3p 和 hsa_miR-1274a 最顯著，差異倍數(shù)大于 10); 248 種下調(diào)（hsa-miR-202_3p、hsa-miR-4778_5p、hsa-miR-4711_3p、hsa-miR-4510、 hsa-miR-4777-5p、hsa-miR-4738-5p、hsa-miR-4770、hsa-miR-4789-5p、hsa-miR-4804-5p、 hsa-miR-4696, hsa_miR-476〇-3p、hsa-miR-4781_3p、hsa-miR-4524_3p、hsa-miR-4759 和 hsa-miR-4719最顯著，差異倍數(shù)大于10);由此區(qū)分上皮性卵巢癌組織和正常卵巢組織。
[0029] 本發(fā)明的第三方面，提供一種分離的或人工構(gòu)建的前體miRNA，所述的前體miRNA 能在人細(xì)胞內(nèi)剪切并表達(dá)成權(quán)利要求1所述的miRNA。
[0030] 本發(fā)明還提供一種分離的或人工構(gòu)建的前體miRNA集合或組合，所述的前體 miRNA集合或組合中的前體miRNA能在人細(xì)胞內(nèi)剪切并表達(dá)成第二方面所述的miRNA集合 或組合中的miRNA。
[0031] 本發(fā)