br>[0160] 用盛元公司生產(chǎn)的Sharpvue? miRNA cDNA合成盒（盛元公司產(chǎn)品編號：9000004) 為miRNA加上PolyA的尾,并且反轉(zhuǎn)錄為cDNA。具體步驟為：
[0161] 將I. 5ml離心管置于冰上，加入66微升濃度為125ng/ul的總RNA，33微升盛兀公 司生產(chǎn)的Sharpvue? miRNA cDNA合成反應液I (盛元公司產(chǎn)品編號：9000005) 11微升盛元 公司生產(chǎn)的Sharpvue? miRNAcDNA合成反應液II (盛元公司產(chǎn)品編號：9000006)),和去核 酸酶的超純水至165微升?？俁NA量的終濃度為50ng/ul，輕柔混勻后分裝入3個0. 2ml的 PCR管，每管SOulolOOOrpm離心IOs后放入ABI9700PCR儀進行反應，反應程序：37°C 15min， 25°C 25min，37°C 30min，85°C 5min，4°C 保持。
[0162] 取出PCR管，將3管RT產(chǎn)物合并，震蕩離心后_20°C保存或者直接用于qPCR反應。
[0163] 實施例4
[0164] 熒光定量PCR檢測
[0165] 采用CN10267663A中所公開的方法檢測小RNA。
[0166] 在15毫升的離心管中加入141微升實施例3得到的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，10542微升的熒 光定量PCR酶反應液（盛元公司產(chǎn)品編號：9000008, Sharpvue? 2x Universal qPCR Master Mix High Rox)，4076微升去核酸酶超純水（盛元公司產(chǎn)品編號：9000015)，輕柔混勻。
[0167] 將盛兀公司生產(chǎn)的小RNA反應模板，Sharpvue?Human miRNA Array-A vl. 0 (盛 兀公司產(chǎn)品編號：1000002)，Sharpvue?Human miRNA Array-B vl.O(盛兀公司產(chǎn)品編 號：1000003)，Sharpvue?Human miRNA Array-C vl. 0(盛元公司產(chǎn)品編號：1000004)， Sharpvue?Human miRNA Array-D vl.0(盛兀公司產(chǎn)品編號：1000005)，Sharpvue?Human miRNA Array-E vl.O(盛元公司產(chǎn)品編號：1000006)從-20°C冰箱中取出，待回復到室溫后 打開包裝袋，置于離心機上，2000g離心5min (Thermo、ST16R，轉(zhuǎn)頭型號：M-20)。共1757個 小RNA反應液，每個反應模板上有3對陽性對照和1個空白對照。小心解開封膜。
[0168] 將前述步驟得到的混合液倒入加樣槽中，使用12道連續(xù)移液器將混合液逐行分 別加入到上述小RNA反應模板中，每孔7ul。加樣完畢后檢查每個孔液體量是否均一。
[0169] 使用定量封板膜（ABI，4711971)封板后顛倒混勻，室溫1000 g離心5min。
[0170] 放入定量PCR儀中（ABI，7900Ht Fast)做定量PCR。程序為：95°C 2min，后運行 96°C 5s，60°C lmin，3個循環(huán)；之后96°C 5s，60°C 5s，37個循環(huán)，溶解曲線。報告熒光設為 SYBR，參比熒光設為Rox。
[0171] 收集數(shù)據(jù)，進行生物信息學分析。
[0172] 實施例5
[0173] miRNA生物統(tǒng)計數(shù)據(jù)的計算分析
[0174] 小RNA數(shù)據(jù)分析圖表通過使用R和Bioconductor軟件包進行分析。在檢測的1722 個miRNA和兩個內(nèi)參對照（HSA-RNU6B和HSA-RNU48)，發(fā)現(xiàn)在檢測的63例組織樣本中，每個 miRNA的ct值和平均值被差減背景、歸一化，對1696種miRNA進行進一步的分析。為了去 除樣品中RNA加入量的差異，分位數(shù)-median函數(shù)的分析方法用于處理原始的ct值（Sing 等人；2005)，我們對卵巢微陣列數(shù)據(jù)進行全部中值歸一化。此過程使隨后的統(tǒng)計分析去除 了兩個上皮性卵巢癌組織樣本，一個上皮性的邊緣卵巢癌組織樣本，以及一個正常的上皮 性卵巢組織樣本。
[0175] 在隨后的統(tǒng)計分析，45例卵巢癌（39例上皮性卵巢癌組織和6例上皮性的邊緣卵 巢癌組織）與14例正常卵巢組織之間的miRNA比較差異表達的miRNA通過使用t檢驗分 析所得，倍數(shù)變化2以上的被稱為差異表達。
[0176] 差異表達的miRNA通過使用三種計算機算法：支持向量法（SVM, Bioconductor package "el071"），KNN 算法（Bioconductorpackage "class"）和對角線線性判別分析法 (Bioconductor package "sfsmisc")，算法的性能采用留一交叉驗證程序，對不同數(shù)量的預 測標志物進行初步評估。對每一組訓練樣本中，miRNA基于卵巢癌組織和正常卵巢組織比 較產(chǎn)生的t檢驗值和p值進行排名。前η的miRNA (η為2和50之間的閾值范圍）被用來 構(gòu)建基于對訓練樣本的信息應用得到其余的測試樣本的預算模型中。挑選FDR調(diào)整的ρ值 低于0. 1，差異變化倍數(shù)變化大于2的miRNA。
[0177] 結(jié)果如表1-表5、圖1和圖2所不。
[0178] miRNA的命名是根據(jù)miRBase Version20的miRNA數(shù)據(jù)庫，在矛盾的情況下，遵循 miRNA數(shù)據(jù)庫。
[0179] 表1 :卵巢癌組織診斷倍數(shù)變化2以上差異表達的425種miRNA序列及表達情況
[0180]
[0181]







[0189] 本發(fā)明各表格中參數(shù)具體如下：miRID=根據(jù)miRBase version20命名的小RNA ; Log FC為倍數(shù)變化的對數(shù)值；Ave. Expr為評價表達值；Adj. P. Val為調(diào)整的P值。Log FC(CE+CB vs. Normal)為（上皮性卵巢癌組織和上皮性的邊緣卵巢癌組織.VS正常卵巢組 織.）的2為底的倍數(shù)變化對數(shù)值；Log FC (CE vs. Normal)為（上皮性卵巢癌組織.VS正常 卵巢組織.）的2為底的倍數(shù)變化對數(shù)值。
[0190] 表1示出在卵巢癌組織和正常卵巢組織中miRNA的顯著差異表達，425種 miRNA在卵巢癌組織中表達倍數(shù)大于2,其中204種上調(diào)（hsa-miR-522、hsa-miR-429、 hsa-miR-141_5p、hsa_miR-200a、hsa-miR-96_5p、hsa-miR-183_5p、hsa_miR-449c、 hsa-miR-205 和 hsa-miR-182_5p 最顯著）；221 種下調(diào)（hsa-miR-202_3p、 hsa-miR-4711-3p、hsa-miR-4778-5p、hsa-miR-4510、hsa-miR-4789-5p 和 hsa-miR-4760_3p 最顯著）。
[0191] 表2示出在上皮性卵巢癌組織和正常卵巢組織中miRN顯著差異表達，489種 miRNA在卵巢癌組織中表達倍數(shù)大于2,其中241種上調(diào)（hsa-miR-522、hsa-miR-429、 hsa-miR-96_5p、hsa-miR-205、hsa-miR-141_5p、hsa-miR-183_5p、hsa_miR-200a 和 hsa-miR-182_5p 最顯著）；248 種下調(diào)（hsa-miR-202_3p、hsa-miR-4778_5p、 hsa-miR-4711-3p、hsa-miR-4510、hsa-miR-4777-5p 和 hsa-miR-4738_5p 最顯著）。
[0192] 表2 :上皮性卵巢癌組織診斷倍數(shù)變化2以上差異表達的489種miRNA序列及表 達情況
[0193]









[0203] 根據(jù)表3中miRNA分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，利用熒光定量PCR的方法檢測45例卵巢癌（C) 組織（包括39例上皮性卵巢癌（CE)組織和6例上皮卵巢癌交接（CB)組織）和14例正 常卵巢（N)上皮組織的1696個小RNA表達（hsa-RNU6B和hsa-RNU48作為內(nèi)參），發(fā)現(xiàn)十 個小RNA組成的指紋圖譜（HSA-MIR-1271-5P和HSA-MIR-574-3P在卵巢癌組織中表達下 調(diào)；HSA-MIR-182-5P、HSA-MIR-183-5P、HSA-MIR-96-5P、HSA-MIR-15B-5P、HSA-MIR-182-3P、 HSA-MIR-141-5P、HSA-MIR-130B-5P 和 HSA-MIR-135B-3P 在卵巢癌組織中過表達），可以更 好地理解卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展機制，并在卵巢癌診斷中的潛在用途。如圖1所示，此指紋圖 譜檢測的靈敏度為97%，特異性為92%，AUC曲線值為0. 978。
[0204] 表3卵巢癌診斷中十個小RNA組成的指紋圖譜表達情況
[0205]
[0206] 根據(jù)表4中miRNA實驗分析結(jié)果還發(fā)現(xiàn)七個小RNA組成的指紋圖譜 (hsa-miR-182_5p、hsa-miR-183_5p、hsa-miR-96_5p、hsa-miR-1271_5p、hsa-miR-182_3p、 hsa-miR-1468-5p和hsa-miR-135b-3p)能區(qū)分上皮性卵巢癌組織和正常組織樣本，如圖2 所示，此指紋圖譜檢測的靈敏度為97%，特異性為85%，AUC曲線值為0. 965。
[0207] 表4上皮性卵巢癌診斷中七個小RNA組成的指紋圖譜表達情況
[0208]
[0209] 根據(jù)表5所示的結(jié)果，還發(fā)現(xiàn)兩個miRNA簇MIR183-96-182 (HSA-MIR-182、 HSA-MIR-183 和 HSA-MIR-96-5P)和 MIR200 家族（HSA-MIR-141-5P、HSA-MIR200A，B，C 和 HSA-MIR-429)在卵巢癌組織樣本中有顯著升高，暗示這些小RNA參與了卵巢癌的發(fā)展。
[0210] 表5HSA-miR-183-96-182家族和HSA-miR200家族在卵巢癌中表達情況
[0211]
[0212] 以上實施例顯示miRNA在人類卵巢癌組織中異常表達，由十個miRNA組成的指紋 圖譜，可以很好的區(qū)分卵巢癌組織和正常卵巢組織，由7個miRNA(其中有6個小RNA和10 個小RNA中的6個是一樣的）組成的指紋圖譜，可以很好地區(qū)分上皮性卵巢癌組織和正常 卵巢組織。
[0213] 進一步地實驗表明，米用 hsa-miR-183_5p、hsa-miR-96_5p 和 hsa-miR-182_5p 組 成的指紋圖譜，也可以用于區(qū)分卵巢癌組織和正常卵巢組織，檢測的靈敏度大于為90%，特 異性大于80%。
[0214] 實施例6
[0215] 卵巢癌特異性miRNA標志物的驗證
[0216] 對于隨機挑選的50個卵巢組織樣本(包括來自25個正常人和25個卵巢癌患者)， 用實施例5中確定的如下miRNA實驗組進行檢測。
[0217] 實驗組一：HSA-MIR-1271-5P、HSA-MIR-574-3P、HSA-MIR-182-5P、 HSA-MIR-183-5P、HSA-MIR-96-5P、HSA-MIR-15B-5P、HSA-MIR-182-3P、HSA-MIR-141-5P、 HSA-MIR-130B-5P、HSA-MIR-135B-3P ;
[0218] 實驗組二：hsa-miR-182-5p、hsa-miR-183-5p、hsa-miR-96-5p、hsa-miR-1271-5p、 hsa-miR-182_3p、hsa-miR-1468_5p、hsa-miR-135b_3p ;
[0219] 實驗組三：hsa-miR-183_5p、hsa-miR-96_5p 和 hsa-miR-182_5p。
[0220] 結(jié)果表明：上述三組均能檢測出80%以上的卵巢癌組織樣本，25個正常卵巢組織 樣本未被錯檢。
[0221] 另外，實驗組二可以很好地區(qū)分上皮性卵巢癌組織和正常卵巢組織。
[0222] 在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨 引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領域技術(shù)人員可 以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求