沃頓膠消化液的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于干細(xì)胞制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種沃頓膠消化液。
【背景技術(shù)】
[0002]間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSC)可在體內(nèi)或體外特定的誘導(dǎo)條件下，分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、神經(jīng)、肝、心肌、內(nèi)皮等多種組織細(xì)胞，且在連續(xù)傳代培養(yǎng)和冷凍保存后仍具有多向分化潛能，可作為理想的種子細(xì)胞用于衰老和病變引起的組織器官損傷修復(fù)。間充質(zhì)干細(xì)胞根據(jù)存在組織的不通，主要包括骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、月旨肪間充質(zhì)干細(xì)胞和臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。其中，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞由于采自醫(yī)療廢棄物新生兒臍帶，相比骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞其具有來(lái)源豐富、成本低、對(duì)捐獻(xiàn)者無(wú)損害等優(yōu)勢(shì)，具有更加廣闊的前景。
[0003]臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞大量存在于臍帶沃頓膠(Wharton膠，或者又稱華爾通膠)和血管周?chē)M織中，具有自我更新、增殖和多向分化潛能。而其中由于沃頓膠的成分主要是膠原、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素(膠原占干重50%以上，以1、I1、III型膠原為主，還有V型等膠原，占總膠原的95%以上；透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素等糖胺多糖占臍帶沃頓膠的近50% )，能更加利于臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離，因此目前臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞多從沃頓膠中進(jìn)行分離制備，而采用的方法一般為組織塊貼壁法和酶消化法。其中，組織塊貼壁法是將臍帶組織切成小塊，用間質(zhì)細(xì)胞完全培養(yǎng)基在一定條件(5% CO2、37°C、飽和濕度)的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5?7d后將貼壁生長(zhǎng)的長(zhǎng)梭形細(xì)胞從組織中消化分離，再過(guò)5?7d后即獲得臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。由于這一方法時(shí)間長(zhǎng)，獲取率和活性均不高，所以現(xiàn)有方式中多采用酶消化法進(jìn)行。
[0004]現(xiàn)通常的酶消化法是將切成小塊的臍帶組織用含膠原酶和胰蛋白酶的消化液消化30min?16h。消化液中的胰蛋白酶是通過(guò)離解細(xì)胞間的粘蛋白、糖蛋白而影響細(xì)胞骨架從而使細(xì)胞分離，對(duì)細(xì)胞間質(zhì)的蛋白成分及細(xì)胞膜蛋白均有很強(qiáng)的破壞作用，因此造成分離到的干細(xì)胞受到損傷導(dǎo)致活性不佳，難以擴(kuò)增出理想數(shù)目和活性的間充質(zhì)干細(xì)胞。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明實(shí)施的目的在于克服上述從沃頓膠分離制備臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的不足，提供一種能夠在制備過(guò)程中對(duì)干細(xì)胞損傷性更低、產(chǎn)率和細(xì)胞品質(zhì)更高的沃頓膠消化液。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明實(shí)施例的技術(shù)方案如下:
[0007]一種沃頓膠消化液，包括透明質(zhì)酸酶和硫酸軟骨素ABC酶。
[0008]采用本發(fā)明的上述沃頓膠消化液，相比現(xiàn)有沃頓膠酶消化中采用的膠原酶和胰蛋白酶，特異性轉(zhuǎn)變?yōu)獒槍?duì)沃頓膠中的硫酸軟骨素和透明質(zhì)酸進(jìn)行酶解，破壞細(xì)胞之間的穩(wěn)定粘合而進(jìn)行分離，可以提升獲取率；同時(shí)在聯(lián)合消化沃頓膠的過(guò)程中避免了胰酶和膠原酶長(zhǎng)期消化對(duì)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞自身膜蛋白的影響，不會(huì)額外的造成干細(xì)胞的胞膜損傷，處理之后分離得到的干細(xì)胞具有更加優(yōu)良的增殖活性和分化能力。
【具體實(shí)施方式】
[0009]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0010]本發(fā)明實(shí)例提供一種用于酶消化法從沃頓膠制備臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的沃頓膠消化液，相比現(xiàn)有由膠原酶和胰蛋白酶組成的消化液，本發(fā)明的消化液包括透明質(zhì)酸酶和硫酸軟骨素ABC酶。
[0011]相比現(xiàn)有沃頓膠酶消化液中采用的膠原酶和胰蛋白酶，本發(fā)明消化液中硫酸軟骨素ABC酶是特異性降解硫酸軟骨素A、硫酸軟骨素B和硫酸軟骨素C的酶類(lèi)，作用機(jī)理是通過(guò)β消除機(jī)理作用于二糖重復(fù)單元之間的β 1-4糖苷鍵上并將其切斷，生成寡糖(主要是不飽和二糖)。同時(shí)，沃頓膠細(xì)胞的間質(zhì)中，大量存在的透明質(zhì)酸是組織基質(zhì)中具有限制水分及其它細(xì)胞外物質(zhì)擴(kuò)散作用的功能成分，也是細(xì)胞生長(zhǎng)和形成組織結(jié)構(gòu)的基質(zhì)成分；因此本發(fā)明在消化液中添加透明質(zhì)酸酶對(duì)透明質(zhì)酸的專一性水解，水解之后首先可以破壞細(xì)胞之間的穩(wěn)定粘合而利于分離，并且在水解的過(guò)程中能暫時(shí)降低細(xì)胞間質(zhì)的粘性加強(qiáng)胞外物質(zhì)的擴(kuò)散和結(jié)合、以及吸收，能進(jìn)一步協(xié)同增加硫酸軟骨素ABC酶的擴(kuò)散和結(jié)合，提升沃頓膠細(xì)胞間成分的降解的效率。并且，其中采用的一個(gè)酶活單位的硫酸軟骨素ABC酶在pH 6.0和37°C條件下lmin可以從硫酸軟骨素A催化產(chǎn)生1.0μmOl 2-乙酰氨基-2-脫氧-3-0- ( β -D-吡喃葡萄糖醛酸-4-烯)-4-0-硫酸-D-半乳糖(Λ Di_4S)或從硫酸軟骨素C催化產(chǎn)生1.0 μ mo I 2-乙酰氨基-2-脫氧-3-0- ( β -D-吡喃葡萄糖醛酸_4_烯)-6-0-硫酸-D-半乳糖(AD1-es)，這個(gè)降解的效率是明顯高于膠原蛋白類(lèi)的降解的，能大大提升消化液的消化效率。
[0012]同時(shí)，由于上述兩種酶類(lèi)本身具有僅對(duì)特異性底物水解的單一性，聯(lián)合消化沃頓膠的過(guò)程中可克服胰酶和膠原酶長(zhǎng)期消化對(duì)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的影響，不會(huì)額外的造成干細(xì)胞的胞膜損傷，處理之后分離得到的間充質(zhì)干細(xì)胞具有更加優(yōu)良的增殖活性和分化能力。
[0013]進(jìn)一步在本發(fā)明的上述消化液實(shí)施中，為了使消化過(guò)程中胞間質(zhì)和酶進(jìn)行相繼結(jié)合并同時(shí)消化，提升消化效率，消化液中透明質(zhì)酸酶和硫酸軟骨素ABC酶的質(zhì)量/酶活比為0.05?2mg/U (購(gòu)買(mǎi)的透明質(zhì)酸酶是質(zhì)量計(jì)，而硫酸軟骨素ABC酶是按照活力單位U計(jì))。在該量比范圍下，酶降解的效率基本和細(xì)胞間質(zhì)中成分的比例相當(dāng)，避免比例不平衡產(chǎn)生產(chǎn)物抑制而降低效率。當(dāng)然，根據(jù)透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素等糖胺多糖占臍帶沃頓膠的近50%的成分特點(diǎn)，透明質(zhì)酸酶和硫酸軟骨素ABC酶最優(yōu)的質(zhì)量/酶活比可以采用0.lmg/Uo
[0014]同時(shí)，由于沃頓膠用消化液進(jìn)行消化的過(guò)程中，大多數(shù)干細(xì)胞自身存在適宜生長(zhǎng)的PH范圍為7.2?7.4，通常低于pH6.8或者高于pH7.6可能對(duì)干細(xì)胞有害，同時(shí)造成消化分離得到的干細(xì)胞胞膜或者胞內(nèi)代謝不正常，并且還會(huì)抑制或者降低得到的干細(xì)胞的活性。更重要地，上述消化液中的主要活性成分為蛋白酶類(lèi)，在消化液制備和使用中，為了防止PH值過(guò)于劇烈的變化而造成蛋白質(zhì)變性，因此在上述基礎(chǔ)上，本發(fā)明的消化液中添加緩沖系作為透明質(zhì)酸酶和硫酸軟骨素ABC酶的溶劑。作為溶劑的緩沖系，根據(jù)細(xì)胞的適應(yīng)性范圍，可以采用PH相符合的常用pKa (酸度系數(shù))=7.2的PBS緩沖系、Tris-HCl緩沖系等。上述緩沖系作為溶劑添加在消化液后，在消化處理的過(guò)程中消化液自身存在無(wú)機(jī)離子，還可有利于維持細(xì)胞外的滲透壓力，避免干細(xì)胞出現(xiàn)吸脹破裂等等。
[0015]在本發(fā)明上述沃頓膠消化液的基礎(chǔ)上，本發(fā)明進(jìn)一步還提出一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法，包括如下步驟:
[0016]S10，獲取臍帶沃頓膠的破碎組織；
[0017]S20，將臍帶沃頓膠組織用沃頓膠消化液進(jìn)行消化處理，并搜集消化液；
[0018]S30，從消化液中提取臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0019]其中，步驟SlO獲取原料沃頓膠的破碎組織，具體實(shí)施中可以采用如下步驟進(jìn)行:
[0020]SI I，獲取臍帶；
[0021]該步驟Sll獲取臍帶可以是生產(chǎn)手術(shù)中剪下的臍帶，或者是其他途徑保存的可以直接使用的臍帶均可；獲取之后的臍帶為了保持其細(xì)胞組織形狀，獲取的臍帶可以放入含抗凝劑的無(wú)菌注射用生理鹽水中，4°C低溫保存?zhèn)溆谩?br>[0022]S12，從步驟Sll獲取的臍帶中分離沃頓膠；
[0023]該步驟中用手術(shù)剪將臍帶外壁剪開(kāi)，并用鑷子去除外壁；可見(jiàn)到透明的膠狀物質(zhì)即沃頓膠，用鑷子仔細(xì)夾取即可得到沃頓膠。
[0024]S13，將步驟S12獲取的沃頓膠剪切破碎，成為便于消化的破碎組織；
[0025]實(shí)施中，剪切破碎的可以采用實(shí)驗(yàn)室常用的手術(shù)剪進(jìn)行，在培養(yǎng)皿中將沃頓膠剪碎成1-2_3的組織塊，剪碎的過(guò)程之前可以先在培養(yǎng)皿中添加破碎緩沖液，對(duì)組織細(xì)胞進(jìn)行保護(hù)。同時(shí)，由于接來(lái)下的步驟是將破碎的組織用于消化，并且本發(fā)明的上述消化液中采用的溶劑即是PBS等緩沖系，因此可以直接采用消化液作為破碎緩沖液直接進(jìn)行，剪碎之后然后直接轉(zhuǎn)移至進(jìn)行步驟S20的消化處理。
[0026]上述組織破碎完成之后，步驟S20進(jìn)一步將獲得的破碎組織進(jìn)行消化處理，按照上述步驟S13以消化液作為破碎緩沖液進(jìn)行切碎之后，破碎的組織漿液中含有消化液，因此不需要再繼續(xù)添加，而可以直接轉(zhuǎn)移至搖床上進(jìn)行震蕩消化；同時(shí)，震蕩消化的過(guò)程中，可以控制消化的溫度為35?37°C，以保證消化過(guò)程中酶的活性最優(yōu)。同時(shí)，消化過(guò)程中，根據(jù)反復(fù)的實(shí)驗(yàn)和測(cè)試，在消化液的添加量合適的情況下，震蕩消化40min消化即可比較完全(如果為了確定保證消化完全，可以適當(dāng)延長(zhǎng)消化的時(shí)間)，得到用沃頓膠消化液消化處理之后生成的消化漿液。
[0027]在步驟S20之后，所生成的消化漿液中就具有較多游離出來(lái)的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，然后步驟S30從這消化漿液中進(jìn)行分離提取即可得到臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。分離的方法可以參見(jiàn)如下步驟進(jìn)行:
[0028]S31，將步驟S20所獲得的消化液于200-400目無(wú)菌篩網(wǎng)上研磨并過(guò)濾后，取濾液(本次濾液中即含有消化過(guò)程中所游離出的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞)；
[0029]S32，將步驟S31的濾液用含10 % FBS (胎牛血清)的DMEM/F12完全培養(yǎng)液進(jìn)行終止消化處理；其中，上述完全培養(yǎng)液按照實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)配置中，均是按照10%的量比添加，實(shí)際實(shí)施中只要能滿足細(xì)胞的生長(zhǎng)要求，可以適當(dāng)?shù)脑鰷p，控制在8?12%的范圍左右。
[0030]S33，將步驟S32終止消化處理后的濾液中加入PBS后，200g離心5min后棄去上清，則下層沉淀即為分離的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，然后再次用PBS重懸細(xì)胞后離心洗滌；重復(fù)洗滌3次后，搜集細(xì)胞體即為臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0031]本發(fā)明的上述實(shí)施過(guò)程完成之后，一般量較少，因此