在本發(fā)明中可以需要進(jìn)一步按照步驟S40進(jìn)行傳代擴(kuò)增:
[0032]S40，向步驟S30分離提取得到的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞中用完全培養(yǎng)液進(jìn)行大量培養(yǎng);
[0033]在培養(yǎng)的過程中適時(shí)地更換新鮮培養(yǎng)液，同時(shí)觀察并記錄細(xì)胞形態(tài)。
[0034]本發(fā)明的上述制備的方法在酶消化的過程中采用透明質(zhì)酸酶和ABC酶聯(lián)合消化沃頓氏膠，整體上可以獲得細(xì)胞品質(zhì)最優(yōu)的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，并且避免了胰酶和膠原酶長(zhǎng)期消化對(duì)細(xì)胞體的影響，最終制備得到的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞活性較高，獲取率較高。
[0035]為使本發(fā)明的上述實(shí)施的技術(shù)細(xì)節(jié)和過程方法能更易于本領(lǐng)域技術(shù)人員的理解和實(shí)施參考，同時(shí)凸顯出本發(fā)明消化液制備臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的效率和品質(zhì)，以下通過具體的實(shí)施例進(jìn)行舉例說明。
[0036]實(shí)施例1
[0037](I)配置消化液:lg/L透明質(zhì)酸酶(Sigma公司)、100U/ml ABC酶(北京思清源生物科技有限公司)
[0038]將透明質(zhì)酸酶溶解于pH7.2的PBS中，得到質(zhì)量濃度為lg/L透明質(zhì)酸酶溶液50ml，備用；
[0039]將100U/mL硫酸軟骨素ABC酶用pH7.2的PBS稀釋為10U/mL，同樣制備50ml備用；
[0040]最后將透明質(zhì)酸酶溶液與硫酸軟骨素ABC酶按1:1的體積比例混合即可。
[0041]然后采用上述配置的消化液通過酶消化法制備臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，具體:
[0042]S11，生產(chǎn)手術(shù)中剪下的15?20cm的臍帶，放入含抗凝劑的無菌注射用生理鹽水(最好還添加1%雙抗)中，4°C低溫運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室，可以保證細(xì)胞的鮮活，避免因?yàn)椴牧咸幚聿划?dāng)影響后續(xù)干細(xì)胞分離的品質(zhì)；
[0043]S12，用PBS或者注射用生理鹽水洗滌臍帶(清洗的次數(shù)和時(shí)間可以具體清洗過程定，以將臍帶和血管中的血液清洗干凈為準(zhǔn))，去除臍帶和血管中的血液后，用手術(shù)剪將臍帶外壁剪開，并用鑷子去除外壁，可見到透明的膠狀物質(zhì)即沃頓膠，用鑷子仔細(xì)夾取沃頓膠組織然后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，并向培養(yǎng)皿中按照組織:消化液為1:2?5的體積比添加消化液；
[0044]S13，進(jìn)一步用手術(shù)剪將培養(yǎng)皿中將沃頓膠剪碎成l_2mm3的組織塊。
[0045]S20，將步驟S13剪碎之后的的組織塊置于搖床上震蕩消化40分鐘。
[0046]S31，將步驟S20消化之后得到的消化漿液傾倒至300目無菌篩網(wǎng)上過濾并輕細(xì)研磨，棄殘?jiān)覞釣V液；
[0047]S32，將步驟S31中過濾得到的懸濁濾液用含10% FBS的DMEM/F12完全培養(yǎng)液終止消化；
[0048]S33，將步驟S32終止消化處理后的懸濁濾液進(jìn)一步洗滌離心，搜集離心沉淀；其中，洗滌過程中采用2?3倍體積的PBS作為洗滌液，洗滌之后置于1500rpm離心5min ;當(dāng)然，為了保證搜集沉淀中細(xì)胞的潔凈，洗滌和離心可以重復(fù)3?4次；最終搜集到的離心沉淀物即為從沃頓膠中分離制備的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0049]S40，將步驟S33中所獲得的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞沉淀，用含10% FBS的DMEM/F12完全培養(yǎng)液進(jìn)行大量培養(yǎng)；具體培養(yǎng)的細(xì)節(jié)的過程，向步驟S33離心獲得的干細(xì)胞沉淀物中加入含10% FBS的DMEM/F12完全培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)；
[0050]當(dāng)培養(yǎng)12小時(shí)后，吸除舊培養(yǎng)液，并加入新鮮的含10% FBS的DMEM/F12完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；之后每2天進(jìn)行半量換液，同時(shí)觀察細(xì)胞形態(tài)；
[0051]原代培養(yǎng)I?2d，倒置顯微鏡下即可看到貼壁細(xì)胞呈散在分布，為長(zhǎng)梭狀或扁平形細(xì)胞，少數(shù)為多突起的星形細(xì)胞，細(xì)胞有折光性，核仁明顯；3?5d即可達(dá)到80%?90%融合；待細(xì)胞密度達(dá)80%時(shí)，即可收獲細(xì)胞。培養(yǎng)的過程中，另外取第2代臍帶來源貼壁細(xì)胞保存，用于定向誘導(dǎo)性能測(cè)試。
[0052]S50，細(xì)胞的獲取率和活性測(cè)試:
[0053](I)細(xì)胞體數(shù)量檢測(cè):將步驟S40搜獲的細(xì)胞，取標(biāo)準(zhǔn)體積作為樣品，用臺(tái)盼藍(lán)法進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，做3次重復(fù)，得到細(xì)胞數(shù)量為2?3X 107。
[0054](2)免疫表型分析:將細(xì)胞常規(guī)消化后，以PE標(biāo)記的⑶13、⑶29、⑶31、⑶45、⑶34、⑶73 (SH3) ,MHC-1KFITC標(biāo)記的⑶105 (SH2)、⑶44抗體及其相應(yīng)同型對(duì)照標(biāo)記細(xì)胞，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。
[0055](以上流式細(xì)胞儀和其中所用的抗體購自于美國(guó)BDB1sciences公司)
[0056]流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，高表達(dá)的表面為CD13、CD29、CD44、CD73 (SH3)、CD105，極低表達(dá)的表面為⑶31、⑶34、⑶45、MHC-1I，這一表面表達(dá)的結(jié)果與間充質(zhì)干細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞表面標(biāo)志呈高表達(dá)，而造血干細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞表面標(biāo)志極低表達(dá)的情形相符，因此可以判定本發(fā)明的消化液制備得到的細(xì)胞確實(shí)是間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0057](3)分化潛能鑒定:
[0058]①向脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化:以每孔2X 14的密度將步驟S40獲取的細(xì)胞接種在25cmX 25cm塑料培養(yǎng)瓶和6孔板，誘導(dǎo)分化體系為含10% FBS、l(T6mol/L地塞米松、100 μ g/mLl-甲基-3-異丁基-黃嘌呤(IBMX)、50 μ g/mL抗壞血酸的MDM培養(yǎng)基，每3天半量換液I次。第14天采用油紅O染色，于倒置顯微鏡下觀察脂肪滴的形成。
[0059]成脂誘導(dǎo)分化結(jié)果:定向誘導(dǎo)14d后，本實(shí)施例獲取的細(xì)胞可見油紅O染色呈強(qiáng)陽性，倒置顯微鏡下可見細(xì)胞漿中含有脂肪空泡，說明分離出的細(xì)胞具有向脂肪細(xì)胞分化的能力。
[0060]②向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化:細(xì)胞以每孔2X 14的密度接種于25cmX25cm塑料培養(yǎng)瓶和6孔板，誘導(dǎo)分化體系為含1.0X 10_8mol/L地塞米松，2.0 X 10_4mol/L抗壞血酸，7.0X10_3mol/Li3-磷酸甘油的IMDM培養(yǎng)基，每3天半量換液I次。第14天用Von Kossa染色檢測(cè)鈣化基質(zhì)沉淀。
[0061]成骨誘導(dǎo)分化結(jié)果:定向誘導(dǎo)14d后，本實(shí)施例測(cè)試過程中可見細(xì)胞間充滿黑色顆粒，大小不均一，提示有礦化基質(zhì)沉積，具有向成骨細(xì)胞分化的能力，說明本發(fā)明分離出的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞能具有良好的成骨分化能力。
[0062]實(shí)施例2
[0063]本實(shí)施例2為對(duì)比實(shí)施例，在該實(shí)施例2中所采用的臍帶的處理過程與實(shí)施例1相同，而作為對(duì)比的不同點(diǎn)在于本實(shí)施例2中采用含有0.1% (質(zhì)量百分?jǐn)?shù))膠原酶I型和
0.25% (質(zhì)量百分?jǐn)?shù))胰酶(均采購于美國(guó)AMRESC0公司)的PBS溶液作為消化液，按照與實(shí)施例1相同中相同的步驟進(jìn)行臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離制備。
[0064]同樣，本實(shí)施例2中將收獲間充質(zhì)干細(xì)胞按照上述實(shí)施例1的測(cè)試方式進(jìn)行各項(xiàng)數(shù)據(jù)和性能測(cè)試，其結(jié)果如下:
[0065](I)細(xì)胞體數(shù)量檢測(cè)結(jié)果:將搜獲的細(xì)胞，取標(biāo)準(zhǔn)體積作為樣品，用臺(tái)盼藍(lán)法進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，做3次重復(fù)，平均得到細(xì)胞數(shù)量為I X 107。采用該現(xiàn)有通常經(jīng)典常規(guī)消化法制備的細(xì)胞，本身可以確定為間充質(zhì)干細(xì)胞，可以省略免疫測(cè)試的證明步驟。
[0066](2)成脂誘導(dǎo)分化結(jié)果:與實(shí)施例1同樣取第2代臍帶來源貼壁細(xì)胞定向誘導(dǎo)14d后，細(xì)胞油紅O染色陰性，在倒置顯微鏡下也看不見細(xì)胞漿中含有脂肪空泡。
[0067]成骨誘導(dǎo)分化結(jié)果:與實(shí)施例1同樣取第2代臍帶來源貼壁細(xì)胞定向誘導(dǎo)14d后，本組細(xì)胞von Kossa染色未見黑色礦化物沉積。
[0068]從上述兩個(gè)實(shí)施例的對(duì)比的結(jié)果中可以看出，本發(fā)明的消化液相比現(xiàn)有通常采用的膠原酶和胰蛋白酶所獲得的細(xì)胞數(shù)目的2-3倍，干細(xì)胞制備的獲取率要高；同時(shí)，在相同的誘導(dǎo)條件下，細(xì)胞分化的程度，本發(fā)明消化液制備的干細(xì)胞分化程度更為明顯。雖然，在上述實(shí)施例2的14d誘導(dǎo)之后持續(xù)延長(zhǎng)誘導(dǎo)，細(xì)胞傳代更長(zhǎng)之后，再次進(jìn)行誘導(dǎo)結(jié)果的測(cè)試，也能得到陽性的測(cè)試結(jié)果。但是明顯可以看出，通常消化液制備的細(xì)胞需要誘導(dǎo)的程度比本發(fā)明消化液制備的干細(xì)胞分化潛能和活性要低。本發(fā)明制備的間充質(zhì)干細(xì)胞的方法在效果上更加突出和明顯。
[0069]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包括在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種沃頓膠消化液，其特征在于，包括透明質(zhì)酸酶和硫酸軟骨素ABC酶。2.如權(quán)利要求1所述的沃頓膠消化液，其特征在于，所述透明質(zhì)酸酶和硫酸軟骨素ABC酶的質(zhì)量/酶活比為0.05?2mg/U。3.如權(quán)利要求1或2所述的沃頓膠消化液，其特征在于，所述沃頓膠消化液還包括緩沖體系。4.如權(quán)利要求3所述的沃頓膠消化液，其特征在于，所述緩沖體系為PBS緩沖系或Tris-HCl緩沖系。5.如權(quán)利要求3或4所述的沃頓膠消化液，其特征在于，所述緩沖體系的pKa為7.2。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種沃頓膠消化液，包括透明質(zhì)酸酶和硫酸軟骨素ABC酶。采用本發(fā)明的沃頓膠消化液聯(lián)合消化沃頓膠的過程中可克服胰酶和膠原酶長(zhǎng)期消化對(duì)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的影響，不會(huì)額外的造成干細(xì)胞的胞膜損傷，處理之后分離得到的干細(xì)胞具有更加優(yōu)良的增殖活性和分化能力。本發(fā)明的方法制備得到的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，相比現(xiàn)有采用胰酶和膠原酶消化制備干細(xì)胞的方法，從相同的臍帶組織中，具有更高的干細(xì)胞獲取率，并且獲得的干細(xì)胞具有更高的細(xì)胞活性和分化潛能。
【IPC分類】C12N5/0775, C12N9/88, C12N9/26
【公開號(hào)】CN104988119
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510395499
【發(fā)明人】曾憲卓, 魯菲
【申請(qǐng)人】深圳愛生再生醫(yī)學(xué)科技有限公司
【公開日】2015年10月21日
【申請(qǐng)日】2015年7月8日