流感病毒rna聚合酶純化或結(jié)晶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種流感病毒RNA聚合酶純化或結(jié)晶的方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 流感病毒，尤其是甲型流感病毒一直是威脅人類(lèi)社會(huì)的一個(gè)大問(wèn)題，它具有廣泛 的宿主范圍包括人、豬、馬和禽類(lèi)等，可W造成人類(lèi)及動(dòng)物上呼吸道感染，即流行性感冒，由 于其可W借空氣迅速的傳播，在上個(gè)世紀(jì)造成數(shù)次世界性的大流行。流感病毒屬于正黏病 毒科，為負(fù)鏈單鏈RNA分節(jié)段基因組病毒，其基因組分為8段，目前發(fā)現(xiàn)至少可編碼16個(gè)蛋 白。雖然目前存在不少抗流感病毒藥物和疫苗，但是送些藥物和疫苗主要針對(duì)流感病毒表 面蛋白，如HA，NA和M2。由于流感病毒在藥物壓力下可W通過(guò)突變或者基因重組改變其表 面抗原，送些表面蛋白經(jīng)過(guò)突變的毒株將具有抗藥性，從而可能引起無(wú)法控制的流感流行。 為了解決藥物和疫苗的抗藥性問(wèn)題，人們?cè)诳紤]改變思路來(lái)研發(fā)廣譜性抗流感藥物。
[0003] 隨著對(duì)流感病毒復(fù)制機(jī)制的研究，人們逐漸將眼光集中在病毒的核糖核蛋白R(shí)NP 上。流感病毒RNP是流感病毒復(fù)制的核必組分。與病毒表面蛋白不同，流感病毒的RNP更 為保守，它由病毒基因組、RNA聚合酶和纏繞在病毒基因組RNA上的多個(gè)核蛋白組成，負(fù)責(zé) 病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。流感病毒聚合酶是流感病毒復(fù)制的核必機(jī)器，它是由PA、PB1和PB2 H 個(gè)亞基組成的大小約為250千道爾頓（KDa)的H元復(fù)合物，可W產(chǎn)生H種類(lèi)型的RNA，分別 是cRNA、vRNA和mRNA，該聚合酶在病毒的生命活動(dòng)中既參與病毒基因組的轉(zhuǎn)錄復(fù)制過(guò)程， 同時(shí)有文章報(bào)道該復(fù)合物也參與病毒的組裝。
[0004] 盡管人們通過(guò)生物化學(xué)，遺傳學(xué)，生物信息學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)對(duì)流感病毒聚合酶進(jìn) 行了各方面的深入研究，提出了越來(lái)越精細(xì)的模型，關(guān)于聚合酶的工作機(jī)制方面仍然有很 多關(guān)鍵問(wèn)題尚無(wú)法解決，例如；聚合酶如何調(diào)控轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過(guò)程；在復(fù)制過(guò)程中，兩個(gè)聚合 酶分子如何協(xié)調(diào)W啟動(dòng)和終止復(fù)制等；此外，聚合酶還參與病毒的組裝和抵御宿主免疫系 統(tǒng)。為了解決送些問(wèn)題，十分需要一個(gè)原子分辨率的聚合酶整體結(jié)構(gòu)，然而由于流感病毒聚 合酶是一個(gè)250KD的復(fù)合物，為了 W行使其多種功能，可能具有多種構(gòu)象，送給結(jié)構(gòu)生物學(xué) 研究、尤其是晶體結(jié)構(gòu)的獲得造成了極大的障礙，因此即使經(jīng)過(guò)了數(shù)十年的努力，仍沒(méi)有流 感病毒聚合酶整體復(fù)合物的結(jié)構(gòu)得到報(bào)道。
[0005]目前，人們?cè)谥亟M蛋白表達(dá)純化，晶體優(yōu)化和結(jié)構(gòu)解析方面積累了大量的經(jīng)驗(yàn)，通 常情況下，純化得到足夠量的穩(wěn)定均一的蛋白質(zhì)、并由此獲得結(jié)晶仍然是大分子晶體結(jié)構(gòu) 分析的主要瓶頸。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明公開(kāi)了一種流感病毒RNA聚合酶結(jié)晶的方法。
[0007] 本發(fā)明提供的一種流感病毒RNA聚合酶結(jié)晶的方法，包括如下步驟；為先將流感 病毒RNA聚合酶的PB1亞基編碼基因、PA亞基編碼基因和PB2亞基截短體的編碼基因在昆 蟲(chóng)細(xì)胞中共表達(dá)、純化，得到RNA聚合酶，再將所述RNA聚合酶與RNA結(jié)合形成復(fù)合體，再將 所述復(fù)合體結(jié)晶，得到流感病毒RNA聚合酶晶體；
[0008] 所述PB2亞基截短體為PB2亞基氨基酸序列自N末端起前126位氨基酸殘基形成 的蛋白。
[0009] 上述方法中，所述流感病毒為A型流感病毒，所述A型流感病毒的病毒株具體為 冊(cè)NUH1N1或冊(cè)肥。
[0010] 上述方法中，所述昆蟲(chóng)細(xì)胞為化曲Five細(xì)胞。
[0011] 上述方法中，所述將流感病毒RNA聚合酶的PB1亞基編碼基因、PA亞基編碼基因 和PB2亞基截短體的編碼基因在昆蟲(chóng)細(xì)胞中共表達(dá)采用Bac-to-BacBac-to-Bac桿狀病毒 表達(dá)系統(tǒng)，所述Bac-to-BacBac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中的供體質(zhì)粒為pFas1:Bac，大腸 桿菌為DHlOBac，昆蟲(chóng)細(xì)胞為Sf9。
[0012] 上述方法中，所述PB1亞基的氨基酸序列為序列表中序列1所示；
[001引所述PA亞基的氨基酸序列為序列表中序列3所示；
[0014] 所述PB2亞基的氨基酸序列為序列表中序列2所示；
[0015] 所述PB2亞基截短體的氨基酸序列為序列表中序列2自N末端第1-126位。
[0016] 上述方法中，所述PB1亞基的編碼基因的核巧酸序列為序列表中序列4所示；
[0017] 所述PA亞基的編碼基因的核巧酸序列為序列表中序列6所示；
[0018] 所述PB2亞基截短體的編碼基因的核巧酸序列為序列表中序列5自5'末端第 1-378 位。
[0019] 上述方法中，所述純化為將共表達(dá)得到的所述RNA聚合酶依次經(jīng)親和層析、離子 交換層析和凝膠層析，得到純化后的RNA聚合酶；
[0020] 所述結(jié)晶采用的緩沖液由終濃度為2 % -30 %的陽(yáng)G1000-20000、終濃度為 50mM-500mMNa化和濃度為lOOmM、抑值為8. 5的Tris肥L緩沖液組成；
[0021 ] 所述結(jié)晶義用的溫度為4 C -20 C。
[0022] 由上述的方法制備的RNA聚合酶晶體也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0023] 上述的RNA聚合酶晶體在抗流感病毒藥物篩選或疫苗設(shè)計(jì)和制備中的應(yīng)用也是 本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0024] 本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，經(jīng)過(guò)使用不同的PB2截短體嘗試，發(fā)現(xiàn)含有PB2氨基端126 位氨基酸片段的流感病毒聚合酶復(fù)合體表達(dá)量更高，每升昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)液可W純化出2-10 毫克蛋白，優(yōu)于其它截短體表達(dá)量（通常為Img/L);純度好，降解輕微（其它截短體存在降 解、聚合等現(xiàn)象較多，該截短體在送些方面表現(xiàn)更好）；結(jié)晶重復(fù)性更好、晶體更好更大、衍 射也更強(qiáng)。因此，優(yōu)選含有PB2氨基端126位氨基酸片段的流感病毒聚合酶復(fù)合體進(jìn)行表 達(dá)純化結(jié)晶。
[00巧]本發(fā)明的方法解決了長(zhǎng)久W來(lái)的一個(gè)重要問(wèn)題，即如何有效表達(dá)純化一個(gè)含有大 部分流感病毒RNA聚合酶復(fù)合體成分的復(fù)合體，特別是含有完整PB1結(jié)構(gòu)的該蛋白復(fù)合物， 并使之結(jié)晶，送一方法不僅為流感病毒聚合酶的結(jié)構(gòu)解析奠定基礎(chǔ)，同時(shí)，對(duì)抗流感病毒藥 物篩選、廣譜性疫苗和藥物的設(shè)計(jì)研發(fā)進(jìn)程也將具有重要意義和應(yīng)用價(jià)值。
【附圖說(shuō)明】
[0026] 圖1為含有PB2-126截短體的流感病毒RNA聚合酶離子交換層析純化結(jié)果
[0027] 圖2為含有PB2-126截短體的流感病毒RNA聚合酶凝膠過(guò)濾層析純化結(jié)果
[0028] 其中，圖2A是未加RNA promoter的凝膠過(guò)濾層析結(jié)果，目的蛋白峰出現(xiàn)在約56 毫升處；圖2B是加入RNA promoter的凝膠過(guò)濾層析結(jié)果，目的蛋白峰出現(xiàn)在約53毫升處。 藍(lán)色曲線代表UV280吸收曲線；紅色曲線代表UV260吸收曲線。豎粉直線是上樣時(shí)刻。
[0029] 圖3為含有PB2-126截短體的流感病毒RNA聚合酶SDS-PAGE電泳結(jié)果
[0030] M孔道代表分子量標(biāo)準(zhǔn)樣孔道；S孔道是純化的目的蛋白樣品孔道
[0031] 圖4為含有PB2-126截短體的流感病毒RNA聚合酶晶體圖片
[0032] 兩個(gè)圖中箭頭所指為含有PB2-126片段的流感病毒RNA聚合酶復(fù)合體結(jié)晶圖片， 呈長(zhǎng)方塊、立方塊或柱形多邊形。
[0033] 圖5為含有PB2-130截短體的流感病毒RNA聚合酶復(fù)合體分子篩純化圖譜
[0034] 圖6為含有PB2-130截短體的流感病毒RNA聚合酶復(fù)合體的純化結(jié)果
[0035] 其中，圖6A為含有PB2-130截短體的流感病毒RNA聚合酶復(fù)合體電泳圖，1-2為媒 柱層析后電泳、3為離子交換后電泳、4-5為分子篩層析后電泳
[003引圖6B為離子交換圖譜，藍(lán)色曲線（上面的曲線）為樣品在UV280的吸收情況；紅 色曲線（下面的曲線）代表UV260吸收；黑色曲線代表離子交換鹽濃度的增加過(guò)程。
[0037] 圖6C為分子篩純化圖譜，其中黑色曲線代表不加RNA時(shí)UV280和UV260吸收情況， 藍(lán)色曲線代表加入RNA后復(fù)合體洗脫UV280和UV260吸收情況。
[0038] 圖7為含有不同PB2截短體的流感病毒RNA聚合酶復(fù)合體純化后的電泳圖譜
[0039] 圖8為含有PB2-130截短體的流感病毒RNA聚合酶復(fù)合體電鏡結(jié)果及結(jié)晶圖片
[0040] 其中A和B為二體及四體的電鏡結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果、C為四體加入vRNA后的結(jié)晶照片、 D為結(jié)晶電泳檢測(cè)圖
[0041] 圖9為含有不同PB2截短體的流感病毒RNA聚合酶復(fù)合體的結(jié)晶圖片
【具體實(shí)施方式】
[0042] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0043] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0044] 實(shí)驗(yàn)所用昆蟲(chóng)表達(dá)載體pFASTBAC和pFas巧ac-Dual及細(xì)胞培養(yǎng)基SF900II SFM 均購(gòu)自Invitrogen公司。所需RNA均由Takara公司合成，媒親和柱購(gòu)自Qiagen公司 (Ni-NTA Agarose,產(chǎn)品目錄號(hào)；30230)，SP陽(yáng)離子交換柱化口RAP SP HP，產(chǎn)品目錄號(hào)： 17-1152-01)和 Superdex20016/60 凝膠層析柱化iLoadl6/600Superdex200pg，產(chǎn)品目錄 號(hào)=28-9893-35)購(gòu)自GE公司。檢測(cè)PA、PB1和PB2所用抗體通過(guò)表達(dá)相應(yīng)蛋白多膚，免疫 兔獲得多克隆抗體，經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證特異性良好。
[0045] 昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)體系采用的是Invitrogen公司的Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng) (Bac-t〇-Bac? Ba州lovirus Expression System,目錄號(hào)；10359-〇16)，其中供體質(zhì)粒為 P化stBac，進(jìn)行重組病毒構(gòu)建的大腸桿菌為DHlOBac (該菌株含有可在細(xì)菌和昆蟲(chóng)之間轉(zhuǎn) 移和擴(kuò)增的穿梭質(zhì)粒Bacmid和能表達(dá)轉(zhuǎn)座酶的化Iper質(zhì)粒），昆蟲(chóng)細(xì)胞為Sf9。所用昆蟲(chóng) 細(xì)胞培養(yǎng)基為Invitrogen公司的SF900II SFM。
[0046]本發(fā)明的實(shí)施例均W流感病毒毒株Influenza virus/A/Guangdong/ goose/196化5N1) ( W下簡(jiǎn)稱(chēng)；H5N1)為例，但其余的流感病毒尤其是A型流感病毒毒株中的 流感病毒RNA聚合酶的H個(gè)亞基也可W通過(guò)本發(fā)明的方法進(jìn)行結(jié)晶。
[0047] 冊(cè)N1的RNA聚合酶聚合體的；個(gè)亞基包括PB1蛋白、PA蛋白和PB2蛋白，且PB1 蛋白的氨基酸序列為序列1，其編碼基因的核巧酸序列為序列4 ;PA蛋白的氨基酸序列為序 列3,其編碼基因的核巧酸序列為序列6 ;PB2蛋白的氨基酸序列為序列2,其編碼基因的核 巧酸序列為序列5。
[0048] 實(shí)施例1、含有PB2-126截短體的流感病毒RNA聚合酶的結(jié)晶
[0049] 本實(shí)施例預(yù)結(jié)晶的流感病毒RNA聚合酶聚合體的H個(gè)亞基包括PB1蛋