白、PA蛋白 和PB2-126截短體；
[0050] PB2-126截短體的氨基酸序列為序列2自N末端第1-126位氨基酸，其編碼基因為 序列5自5'末端第1-378位核巧酸。
[0051] 一、流感病毒RNA聚合酶的獲得
[0052] 1、流感病毒RNA聚合酶各亞基的表達(dá)
[0053]1)、表達(dá)流感病毒RNA聚合酶各亞基的重組載體的構(gòu)建
[0054] -般性的說，通過基因合成方法根據(jù)NCBI網(wǎng)站公開的基因序列分別合成冊N1， WSN，PR8,1918,冊N2基因DNA。針對各自序列，分別設(shè)計DNA引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得各病 毒的流感病毒RNA聚合酶各亞基的基因，按照Invitrogen的Bac-to-Bac系統(tǒng)使用指南手 冊，通過分子克隆方法，將H種亞基PB1，PB2及PA基因分別克隆到pFas巧ac基因表達(dá)載體 上，用于在昆蟲細(xì)胞表達(dá)送些基因。其中PB1及PA為全長基因，PB2為截斷體基因。
[00巧]由于后期要進(jìn)行媒柱純化，因此需要在亞基PB2-126或PB1的駿基端加入HIS 標(biāo)簽，兩種都進(jìn)行實驗，發(fā)現(xiàn)在復(fù)合體表達(dá)過程中，含有組氨酸標(biāo)簽的蛋白只需在亞基 PB2-126和PB1任一個亞基上即可，沒有必要PB1及PB2亞基同時都含有組蛋白標(biāo)簽。
[0056] 在亞基PB2-126的駿基端加入HIS標(biāo)簽，擴(kuò)增亞基PB2-126編碼基因的駿基端引 物為 5, ATCTCGAGTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTTTAACCTTTCAACCTTCTCAAAGTATG3,，含終止子， 含6個串聯(lián)的組氨酸標(biāo)簽；
[0057] 在亞基PB2-126的駿基端不加入HIS標(biāo)簽，擴(kuò)增亞基PB2-126編碼基因的駿基端 引物為 5, ATCTCGAGTTATTTTAACCTTTCAACCTTCTCAAAGTATG3,；
[0058] 在亞基PB1的駿基端加入HIS標(biāo)簽，擴(kuò)增亞基PB1編碼基因的駿基端引物為：
[0059]5，ATCTCGAGCATGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTTTTGCCGTCTGAGCTCTTCAATGG3，，終止密碼 子之前加入六個連續(xù)排列的組氨酸化HI巧；
[0060] 在亞基PB1的駿基端不加入HIS標(biāo)簽，擴(kuò)增亞基PB1編碼基因的駿基端引物為：
[0061] 5'ATCTCGAGCTATTTTTGCCGTCTGAGCTCTTCAATGG3'。
[0062] 下面的實驗W均為在PB1的駿基端加入HIS標(biāo)簽為例。
[0063] (1)重組載體pFas巧ac-PB2-。 6的獲得
[0064]氨基端引物序列為 5' ATGGATCCATGGAGAGAATAAAAGAATTAAGAG3';駿基端引物為： 5 > ATCTCGAGTTATTTTMCCTTTCAACCTTCTCAAAGTATG3 >
[006引 W PB2蛋白的編碼基因為模板，用上述氨基端引物和駿基端引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得 至IJPCR產(chǎn)物。
[0066] 將該PCR產(chǎn)物分別酶切后連接到載體pFas巧ac質(zhì)粒上的克隆位點上，從而構(gòu)建出 表達(dá)PB2氨基端含1-126位氨基酸殘基片段的重組載體。
[0067] 經(jīng)過測序，該重組載體為將序列表中序列5自5'末端第1-378位核巧酸所示的 PB2-126截短體蛋白的編碼基因插入表達(dá)載體pFASTBAC載體的BamHI和化〇1酶切位點間， 表達(dá)PB2-126截短體蛋白，得到的重組載體，命名為pFas巧ac-PB2-126。
[0068] (2)重組載體pFas巧ac-PBl的獲得
[0069]設(shè)計 DNA 引物，其中 5' 端引物為；ATGGATCCATGTCAATCCGACTTTACTTTTCTT;
[0070] 在3'端引物上、終止密碼子之前加入六個連續(xù)排列的組氨酸化HI巧為；ATCTCGA GCATGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTTTTGCCGTCTGAGCTCTTCAATGG。
[0071] WPB1合成的全長基因為模板，用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物，將PCR 產(chǎn)物克隆到載體pFas巧ac上，得到重組載體。
[0072] 經(jīng)過測序，該重組載體為將序列表中序列表中序列4所示的PB1亞基編碼基因和 在其后面加入6個his標(biāo)簽編碼基因融合的DNA分子插入表達(dá)載體pFASTBAC中BamHI和 化〇1酶切位點得到的重組載體pFas巧ac-PBl，為重組供體質(zhì)粒pFas巧ac-PBl。
[0073] (3)重組載體pFas巧ac-PA的獲得
[0074]氨基端引物為；5' ；ATGGATCCATGGAAGACTTTGTGCGACAATGCTT;駿基端引物為；ATCT CGAGCTATTTTAGTGCATGTGTGAGGAAGGAG。
[00巧]W PA合成的全長基因為模板，用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物，將PCR產(chǎn) 物克隆到載體pFas巧ac上，得到重組載體。
[0076] 經(jīng)過測序，該重組載體為該重組載體為將序列表中序列表中序列6所示PA亞基的 編碼基因插入表達(dá)載體pFASTBAC的BamHI和化〇1酶切位點間得到的重組載體，為重組供 體質(zhì)粒 pFas1:Bac-PA。
[0077]2)、重組昆蟲桿狀病毒的制備
[0078](1)重組大腸桿菌和重組穿梭質(zhì)粒的獲得
[0079] 按照Invitrogen提供的實驗手冊，將上述1)制備的重組載體pFas巧ac-PBl、 pFas巧ac-PA和pFas巧ac-PB2-126作為供體質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DHlOBac，目的基 因在化Iper質(zhì)粒表達(dá)的轉(zhuǎn)座酶的協(xié)助下與穿梭質(zhì)粒Bacmid重組，得到重組菌PB1、重組菌 PA和重組菌PB2-126。
[0080] 提取重組菌PB1的Bacmid質(zhì)粒，為重組穿梭載體Bacmid-PBl;
[0081] 提取重組菌PA的質(zhì)粒，為重組穿梭載體Bacmid-PA ;
[0082] 提取重組菌PB2-126的質(zhì)粒，為重組穿梭載體Bacmid-PB2-126。
[0083] (2)重組昆蟲桿狀病毒的制備
[0084] 流感病毒RNA聚合酶H個亞基能形成緊密的復(fù)合體。
[0085] 將重組穿梭載體Bacmid-PB2-126、Bacmid-PBl、Bacmid-PA分別轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞Sf9 細(xì)胞系，72小時分別收集上清液，得到表達(dá)PB2-126的重組昆蟲桿狀病毒、表達(dá)PB1的重組 昆蟲桿狀病毒、表達(dá)PA的重組昆蟲桿狀病毒，由此獲得第一代（P1)各亞基表達(dá)的病毒。
[0086] 將上述產(chǎn)生的表達(dá)PB2-126的重組昆蟲桿狀病毒、表達(dá)PB1的重組昆蟲桿狀病毒、 表達(dá)PA的重組昆蟲桿狀病毒分別通過兩次轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞系S巧細(xì)胞W進(jìn)行病毒擴(kuò)增，得到 擴(kuò)增的P3代表達(dá)PB2-126的重組昆蟲桿狀病毒、P3代表達(dá)PB1的重組昆蟲桿狀病毒、P3代 表達(dá)PA的重組昆蟲桿狀病毒。
[0087] 檢測滴度，P3代病毒滴度可W達(dá)到l〇7p化/mL W上，可W用于蛋白質(zhì)表達(dá)純化。若 病毒滴度較低，可用P3代病毒再次感染Sf9細(xì)胞系，得到滴度較高的P4代桿狀病毒用于蛋 白質(zhì)表達(dá)。
[0088] 3)、流感病毒RNA聚合酶的表達(dá)
[0089] 將上述2)得到P3代表達(dá)PB2-126的重組昆蟲桿狀病毒、P3代表達(dá)PB1的重組 昆蟲桿狀病毒、P3代表達(dá)PA的重組昆蟲桿狀病毒等滴度量（滴度均為108p化/mL)混合 后按 10vi;ruspaticles/Cell(M0I = 10 ;MOI:multiplicity of infection)轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞 化曲Five, 48小時后收集培養(yǎng)液，500 Xg4°C離必10分鐘收集細(xì)胞。將上述收獲的細(xì)胞按 照1:10(質(zhì)量：體積）溶解于裂解緩沖液中（25mM Tris，250mM化Cl，p冊.0)，使用超聲破 碎細(xì)胞，具體在〇°C冰液中保溫放置裝有細(xì)胞懸液的容器，在30w功率/50mL細(xì)胞溶液比率 下，按照超聲3砂停6砂方式總計超聲破碎30分鐘的方式充分裂解，之后，40, 000 X g4C離 必30分鐘，收集細(xì)胞裂解液上清液，即為含有PB2-126截短體流感病毒RNA聚合酶的上清 液。可W反復(fù)離必2次W便盡可能除去雜質(zhì)。
[0090] 上述裂解緩沖液按照如下方法制備：將如下溶質(zhì)按照如下終濃度溶解在水中得到 的溶液：250mM化Cl、25mM Tris，調(diào)節(jié)裂解緩沖液的抑值為8. 0。
[0091] 2、流感病毒RNA聚合酶的媒柱親和層析純化
[0092] 將上述1得到的含有PB2-126截短體流感病毒RNA聚合酶的上清液吸取到預(yù)冷 的燒杯中，加入適量用裂解緩沖液清洗過的媒柱磁珠（Nickel Beads)，4°C結(jié)合1小時。 500Xg4°C離必3分鐘收集Beads,用裂解緩沖液清洗Bead巧次。加入洗脫緩沖液洗脫 Beads,收集洗脫液；30, 000 X g4°C離必30分鐘，取上清液，即為純化的PB2-126截短體流感 病毒RNA聚合酶。
[0093] 用截留分子量為30, 000道爾頓的超濾管濃縮純化的PB2-126截短體流感病毒RNA 聚合酶至1血。
[0094] 上述洗脫緩沖液按照如下方法制備：將如下溶質(zhì)按照如下終濃度溶解在水中得到 的溶液：25mM4-居己基脈嗦己礙酸、200mM化Cl、250mM咪哇，10%丙H醇；調(diào)節(jié)洗脫緩沖液 的抑值為7.8。
[0095] 將上述純化的PB2-126截短體流感病毒RNA聚合酶用SDS-PAGE檢測。
[0096] 得到分子量約為80邸的PB1亞基條帶、稍小于80邸的PA條帶W及含有126個氨 基酸殘基的PB2條帶（14KD)，表明，得到PB2-126截短體流感病毒RNA聚合酶。
[0097] 分別回收每個亞基的條帶，送去進(jìn)行蛋白N端測序，驗證得確得到冊N1流感病毒 RNA聚合酶的H個亞基，表明電泳檢測的目的大小的條帶得確為冊N1流感病毒RNA聚合酶 的H個亞基。
[0098] 計算含量，每升培養(yǎng)液可獲得lOmg的純化RNA聚合酶（PA-PB1-PB2-126)。
[0099] 二、流感病毒RNA聚合酶的大規(guī)模表達(dá)、純化
[0100] 1、流感病毒RNA聚合酶大規(guī)模表達(dá)
[010。 使用波式反應(yīng)器或錐形瓶或其它類型的細(xì)胞培養(yǎng)瓶，使用SF900II SFM培養(yǎng)基懸 浮培養(yǎng)20L化曲Five細(xì)胞，待細(xì)胞密度生長至2X106cells/mL時，將上述一得到的P3代 表達(dá)PB2-126的重組昆蟲桿狀病毒、P3代表達(dá)PB1的重組昆蟲桿狀病毒、P3代表達(dá)PA的重 組昆蟲桿狀病毒等滴度量（滴度均為l08p化/mL)混合后按1% (體積/體積）加入，27°C 培養(yǎng)60小時，使用離必機(jī)在4°C、離必力4000g下離必10分鐘收集細(xì)胞。
[0102] 在培養(yǎng)過程中，開啟波式反