#RS12JG，TATAA Biocenter AB)并且與添加有 相同濃度的水樣品相比較。用無菌吸入針頭從來自PI組中的14個(gè)受試者的呈現(xiàn)化膿的一 個(gè)植入物位點(diǎn)采集一個(gè)樣品。吸入針頭取樣位點(diǎn)不同，但是類似于紙尖取樣位點(diǎn)。將吸入 針頭（Metal Suction Tip，0? 7x 70mm 22G，Mediplast，MallTlC')，Sweden)插入到選擇的位 點(diǎn)處的植入物周溝/袋的基部。將含有樣品的針頭立即從塑料注射器（lml，BD Plastipak， Mediplast，Mahli6, Sweden)取下，輕輕彎曲并且將其置于一個(gè)（1)4. 5ml塑料冷凍管 (Nunc CryoTube Vials，F(xiàn)isher Scientific，Gdteboi'g.，: Sweden)中。閉合管蓋，并且將管 在具有液氮的保溫瓶中在_196°C放置和冷凍并立即轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室（TATAA Biocenter)用 于抑制分析。當(dāng)操作吸入針和塑料管時(shí)，總是使用潔凈的手套。
[0152] 統(tǒng)計(jì)方法
[0153] 使用方差分析（AN0VA)評價(jià)三個(gè)研究組之間的基因標(biāo)志物表達(dá)的差異。在數(shù)據(jù)分 析中，進(jìn)行對數(shù)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，并且對于獨(dú)立樣品之間的差異，使用百分之九十五（95% )置信 區(qū)間。
[0154] 在對數(shù)變換后使用以下表達(dá)式計(jì)算各個(gè)受試者的歸一化的基因表達(dá)：基因g的歸 一化表達(dá)=(&1(11)-(：(1(3)，其中〇1(3是基因8的擴(kuò)增循環(huán)的數(shù)目，并且〇1(11)是取自受 試者的樣品的歸一化因子（所選的參比基因的擴(kuò)增循環(huán)的平均數(shù)）。使用HI、MC和PI組 中基因g的歸一化表達(dá)來進(jìn)行方差分析。
[0155] 如果HI、MC和PI組之間的可能差異的研究僅包括兩個(gè)遺傳標(biāo)志物，則小于0. 05 的P-值被認(rèn)為是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的。然而，因?yàn)樵贚0Q分析期間已經(jīng)排除了一些之后所述研究 包括8個(gè)標(biāo)志物，使用用于大量顯著性的Bonferroni校正，并且小于0. 0063的p-值被認(rèn) 為是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的。
[0156] 然后將各個(gè)受試者的計(jì)算的歸一化的基因表達(dá)與關(guān)于由相同受試者在相同時(shí)間 點(diǎn)的放射照片提供的骨損失的信息相關(guān)聯(lián)。放射攝影檢查技術(shù)是本領(lǐng)域中公知的并且可以 如在 Ahlqvist 等人（Int J Oral Maxillofac Implantsl990,5(2):155_163)中所述的進(jìn) 行?？梢栽诜派湔掌蠝y量骨水平，并且其被定義為從固定器和其橋基之間的接合處至相 對于植入物中間和遠(yuǎn)端的邊緣骨的頂部的距離。
[0157] 表 1
[0158]

[0172] 表8.具有主要的受損的健康狀態(tài)的受試者的數(shù)量
[0173]
[0174] 實(shí)施例2
[0175] 在獲自經(jīng)歷植入物治療的患者的植入物周溝液中量化TRAP水平。通過實(shí)施例1 中所述的qPCR量化TRAP的表達(dá)水平。然后將獲得的值插入校準(zhǔn)曲線（即圖1)，并且估計(jì) 所述患者的骨損失率。
[0176] 實(shí)施例3
[0177] 在獲自經(jīng)歷植入物治療的患者的植入物周溝液中量化TRAP的表達(dá)水平和0C的表 達(dá)水平。通過實(shí)施例1中所述的qPCR量化TRAP和0C的表達(dá)水平。然后將獲得的值之比 (TRAP/0C)插入校準(zhǔn)曲線（即圖2)，并且估計(jì)所述患者的骨損失率。
[0178] 實(shí)施例4
[0179] 在獲自經(jīng)歷植入物治療的患者的植入物周溝液中量化CatK和0C的水平。通過實(shí) 施例1所述的qPCR量化CatK和0C的表達(dá)水平。然后將獲得的值之比（CatK/OC)插入校 準(zhǔn)曲線（即圖3)，并且估計(jì)所述患者的骨損失率。
[0180] 實(shí)施例5
[0181] 在獲自經(jīng)歷植入物治療的患者的植入物周溝液中量化0PG的水平。通過實(shí)施例1 所述的qPCR量化0PG的表達(dá)水平。然后將獲得的值插入校準(zhǔn)曲線（即圖4)，并且估計(jì)所述 患者的骨損失率。
[0182] 實(shí)施例6
[0183] 在實(shí)施例2-5中的一個(gè)或多個(gè)中，患者可能顯示軟組織炎癥和多至0. 2mm/年的骨 損失率。在該情況下，臨床醫(yī)生可以提供給受試者標(biāo)準(zhǔn)程序的護(hù)理口腔衛(wèi)生處理?？梢栽?數(shù)月或一年內(nèi)安排隨訪。
[0184] 實(shí)施例7
[0185] 在實(shí)施例2-5中的一個(gè)或多個(gè)中，臨床醫(yī)生的結(jié)論是，快速和大量的骨退化可能 在進(jìn)行中（骨損失率>2mm/年），提供給受試者口腔衛(wèi)生處理并且在數(shù)月內(nèi)安排隨訪。如果 在第二次隨訪時(shí)骨損失率保持>2mm/年，臨床醫(yī)生可以決定對該位點(diǎn)進(jìn)行手術(shù)治療。
[0186] 實(shí)施例8
[0187] 在實(shí)施例2-5中的一個(gè)或多個(gè)中，受試者呈現(xiàn)明顯的植入物周炎體征，即植入物 周圍發(fā)炎，腫脹，發(fā)紅，化膿和病理性、彈坑狀邊緣骨損失。然而，骨損失率〈〇. 2mm/年，并且 臨床醫(yī)生的結(jié)論是，不需要手術(shù)治療并且提供給受試者口腔衛(wèi)生處理，維護(hù)方案并且在數(shù) 月內(nèi)安排隨訪。
[0188] 實(shí)施例9
[0189] 在另一實(shí)施例中，取自呈現(xiàn)炎癥和探測時(shí)出血的受試者的樣品顯示，TRAP/0C比率 對應(yīng)于0. 2至0. 5_/年的骨損失率。臨床醫(yī)生的結(jié)論是，骨退化可能非常低和不顯著，并 且提供給受試者標(biāo)準(zhǔn)的護(hù)理口腔衛(wèi)生程序。在數(shù)月或一年內(nèi)安排隨訪。
[0190] 實(shí)施例10
[0191] 在另一個(gè)實(shí)施例中，取自呈現(xiàn)粘膜炎的類似臨床體征的另一受試者的樣品具有對 應(yīng)于超過2_/年的骨損失率的TRAP/0C比。臨床醫(yī)生的結(jié)論是，快速和大量的骨退化可能 在進(jìn)行中，提供給受試者口腔衛(wèi)生處理并在數(shù)月內(nèi)安排隨訪。如果在第二次隨訪時(shí)TRAP/0C 比仍然尚，則臨床醫(yī)生決定對此位點(diǎn)進(jìn)彳丁手術(shù)治療。
[0192] 實(shí)施例11
[0193] 在另一實(shí)施例中，受試者呈現(xiàn)明顯的植入物周炎體征，即植入物周圍發(fā)炎，腫脹， 發(fā)紅，化膿和病理性、彈坑狀邊緣骨損失。然而，TRAP/0C比對應(yīng)于少于0. 5_/年的骨損失 率，并且臨床醫(yī)生的結(jié)論是，不需要手術(shù)治療并且提供給受試者口腔衛(wèi)生處理方案并且在 數(shù)月內(nèi)安排隨訪。
[0194] 不需要將實(shí)施例9至11的受試者暴露于輻射，并且在后兩個(gè)實(shí)施例中，臨床醫(yī)生 不需要等到骨退化已經(jīng)進(jìn)展到通過放射照片評估的可測水平。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 用于測量骨損失率的方法，其中所述方法包括以下步驟： a) 量化活體外樣品中與破骨細(xì)胞和/或成骨細(xì)胞的活性相關(guān)的一種以上標(biāo)志物的表 達(dá)水平或其比率；和 b) 通過將步驟a)中獲得的值插入一個(gè)以上校準(zhǔn)曲線中，確定作為邊緣骨水平的進(jìn)行 中的損失的函數(shù)的骨損失率。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述活體外樣品是體液或組織。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述液體是口腔液、和/或血液、和/或血清、和/ 或血漿、和/或腦脊液、和/或滑液、和/或腹膜液、和/或唾液。4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其中所述液體是齦溝液。5. 根據(jù)權(quán)利要求2至4中一個(gè)或多個(gè)所述的方法，其中所述液體是植入物周溝液。6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述組織是骨和/或結(jié)締組織、和/或骨髓、和/ 或軟骨、和/或齒銀、和/或粘膜。7. 根據(jù)權(quán)利要求2和/或6所述的方法，其中所述組織是骨、和/或植入物支撐組織， 和/或鄰近植入物的骨和/或鄰近牙齒的骨。8. 根據(jù)在前權(quán)利要求中一個(gè)或多個(gè)所述的方法，其中所述標(biāo)志物選自TRAP、OPG、 CatK、RANK、RANKL、骨鈣蛋白、IL-6、DKK-1、MMP-8、HMP-1、tPA、PAI-2、組織蛋白酶家族 成員、骨涎蛋白（BSP)、堿性磷酸酶（ALP)、來自TGF-P超家族的標(biāo)志物、骨形態(tài)發(fā)生蛋白 (BMP)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF)、硬化蛋白、頭蛋白或其任意組合。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述標(biāo)志物是TRAP、OPG、CatK，骨鈣蛋白、或其任 意組合。10. 根據(jù)在前權(quán)利要求中一個(gè)或多個(gè)所述的方法，其中所述量化通過核酸量化的方式 進(jìn)行。11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述量化通過qPCR和/或通過RNA印跡進(jìn)行。12. 根據(jù)在前權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述一個(gè)以上校準(zhǔn)曲線在骨損失率 和標(biāo)志物表達(dá)水平/標(biāo)志物比率或其組合之間提供線性關(guān)系和/或二次方關(guān)系、和/或三 次方關(guān)系、和/或四次方關(guān)系、和/或齊次多項(xiàng)式關(guān)系、和/或指數(shù)關(guān)系、和/或?qū)?shù)關(guān)系。13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述一個(gè)以上校準(zhǔn)曲線在骨損失率和標(biāo)志物表 達(dá)水平/標(biāo)志物比率或其組合之間提供線性關(guān)系。14. 根據(jù)在前權(quán)利要求中一個(gè)或多個(gè)所述的方法，其中確定的骨損失率指示存在或不 存在影響骨的病癥。15. 根據(jù)在前權(quán)利要求中一個(gè)或多個(gè)所述的方法，其中確定的骨損失率指示存在或不 存在影響支撐植入物和/或牙齒的骨的病癥。16. 根據(jù)權(quán)利要求14和/或15所述的方法，其中所述病癥是關(guān)節(jié)炎、和/或類風(fēng)濕性 關(guān)節(jié)炎、和/或銀肩病關(guān)節(jié)炎、和/或骨質(zhì)疏松癥或其組合。17. 根據(jù)權(quán)利要求14和/或15所述的方法，其中所述病癥是植入物周疾病。18. 根據(jù)權(quán)利要求14和/或15所述的方法，其中所述病癥是牙周病。19. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中0. 2mm/年或低于0. 2mm/年的骨損失率指示包 括標(biāo)準(zhǔn)的護(hù)理口腔衛(wèi)生處理和維護(hù)程序的治療。20. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中在1至I. 5_/年范圍內(nèi)的骨損失率指示包括標(biāo) 準(zhǔn)的護(hù)理口腔衛(wèi)生處理和維護(hù)程序和數(shù)月內(nèi)的隨訪的治療。21. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中2. Omm/年或高于2. Omm/年的骨損失率指示外 科治療。22. 試劑盒，所述試劑盒用于進(jìn)行根據(jù)在前權(quán)利要求中一個(gè)或多個(gè)所述的方法。23. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的試劑盒，其中所述試劑盒還包括樣品收集裝置。24. 根據(jù)權(quán)利要求23所述的試劑盒，其中所述樣品收集裝置是無菌紙尖和/或注射器 和/或活檢裝置。25. 根據(jù)權(quán)利要求22至24中一個(gè)或多個(gè)所述的試劑盒，其中所述試劑盒還包括用于保 存樣品的保存介質(zhì)。26. 根據(jù)權(quán)利要求22至25中一個(gè)或多個(gè)所述的試劑盒，其中所述試劑盒還含有關(guān)于如 何進(jìn)行本發(fā)明的方法的使用說明。27. 根據(jù)權(quán)利要求22至26中一個(gè)或多個(gè)所述的試劑盒，其中所述試劑盒還含有用于將 樣品送至中央實(shí)驗(yàn)室的容器。28. 根據(jù)權(quán)利要求22至27中一個(gè)或多個(gè)所述的試劑盒，其中所述試劑盒還含有量化與 破骨細(xì)胞和/或成骨細(xì)胞的活性相關(guān)的一種以上標(biāo)志物或其組合的表達(dá)水平的必要元件。29. 根據(jù)權(quán)利要求22至28中一個(gè)或多個(gè)所述的試劑盒，其中所述試劑盒包含至少一種 可檢測標(biāo)簽和特異識(shí)別與破骨細(xì)胞和/或成骨細(xì)胞活性相關(guān)的一種以上標(biāo)志物或其組合 的至少一種底物。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種診斷骨損失率的方法，尤其是在骨錨定植入物領(lǐng)域中。本發(fā)明提供一種方法，所述方法包括以下步驟：a)量化與活體外樣品中破骨細(xì)胞和/或成骨細(xì)胞的活性相關(guān)的一種以上標(biāo)志物的表達(dá)水平或其比率；和b)通過在一個(gè)以上校準(zhǔn)曲線中插入步驟a)中獲得的值，確定作為邊緣骨水平的進(jìn)行中的損失的函數(shù)的骨損失率。本發(fā)明還涉及用于進(jìn)行所述方法的試劑盒。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號(hào)】CN105008549
【申請?zhí)枴緾N201480007740
【發(fā)明人】簡·霍爾
【申請人】諾貝爾生物服務(wù)公司
【公開日】2015年10月28日
【申請日】2014年2月7日
【公告號(hào)】CA2896980A1, EP2954067A1, WO2014122279A1