8] 3、發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方：酵母膏1~8g/L，玉米漿1~8g/L，蔗糖5~30g/L， KH2P044 ~15g/L，尿素 0· 5 ~4g/L，KN035 ~15g/L，NaC10. 5 ~2. 5g/L，121Γ滅菌 30 分鐘。 其中，蔗糖和尿素分開單獨(dú)滅菌，ll〇°C滅菌20分鐘，滅菌后再合并混勻。另外配制75%葡 萄糖溶液，105 °C滅菌20分鐘，發(fā)酵初期進(jìn)行流加。
[0029] 以下實(shí)施例中使用了下面所列的菌體培養(yǎng)及發(fā)酵液處理方式：
[0030] 1、平板培養(yǎng)：在Yro平板上劃線或涂布后倒置于30°C培養(yǎng)箱內(nèi)，2-3天即可觀察到 大而飽滿的乳白色菌落形成。
[0031] 2、搖床培養(yǎng)：平板上接種單菌落至液體培養(yǎng)基中，或從液體培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接過來，30°C 搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速保持在220轉(zhuǎn)/分鐘。
[0032] 3、發(fā)酵罐培養(yǎng)：可以比較實(shí)時精確控制發(fā)酵條件，如補(bǔ)料控制、pH控制、溶氧控制 和通氣攪拌強(qiáng)度控制等等。第一階段，發(fā)酵液pH控制在5~6. 8,同時流加葡萄糖溶液，為 菌體生長階段；第二階段，發(fā)酵液pH控制在7. 0~7. 8,同時流加底物（烷烴、脂肪酸或脂 肪酸衍生物，如甲酯或乙酯等），以發(fā)酵產(chǎn)酸為主，也生長部分菌體；第三階段，只產(chǎn)酸，不 產(chǎn)菌體，根據(jù)發(fā)酵情況繼續(xù)流加底物（烷烴、脂肪酸或脂肪酸衍生物，如甲酯或乙酯等）。整 個發(fā)酵過程用IOM NaOH溶液自動流加控制pH，同時通過轉(zhuǎn)速的調(diào)整使溶解氧保持在20~ 40%〇
[0033] 4、發(fā)酵液處理：發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液加熱至70~80°C，并維持60分鐘；再加入 IOM NaOH將pH調(diào)至9~9. 5,用管式離心機(jī)或壓濾除去菌體沉淀，保留上清；加入適量活性 炭脫色，溫度保持在70~90°C，保溫時間為60分鐘；除去活性炭后，得到濾清液，用濃鹽酸 或濃硫酸連續(xù)酸化至PH2. 5, 70~90°C保溫2小時，冷卻至30°C，離心或壓濾，清水洗一遍， 清洗后的沉淀取出后真空干燥，得到白色二元酸。
[0034] 實(shí)施例1 :菌株代謝工程改造
[0035] 1)基因組測序
[0036] 利用寶生物工程有限公司的基因組提取試劑盒（Yeast DNAiso Kit)制備長鏈二 元酸生產(chǎn)菌株假絲酵母基因組DNA，具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行?；蚪MDNA再經(jīng)過文 庫構(gòu)建、新一代測序技術(shù)測序分析和數(shù)據(jù)組裝等步驟。通過基因組注釋和數(shù)據(jù)分析，獲得了 生產(chǎn)菌株在二元酸生產(chǎn)相關(guān)的基因信息，挖掘了該菌在ω-氧化和β-氧化代謝途徑相關(guān) 基因的編碼序列。有研究表明（Microbiologyl54:3061-72, 2008)，假絲酵母里F0X2蛋白在 β -氧化代謝中間體跨膜運(yùn)輸過程中起作用，即跨越過氧化物酶體細(xì)胞器的膜。長鏈二元 酸生產(chǎn)菌株基因組里，Candida07204(2664bp)和CandidaA06446(2721bp)開放讀碼框編碼 FOX2,序列相似性高達(dá)97%，上下游區(qū)域序列也高度相似，因而可以判斷是一對等位基因。
[0037] 2)轉(zhuǎn)錄組測序
[0038] 利用德國凱杰公司的RNA提取試劑盒（RNeasy Mini Kit)制備長鏈二元酸生產(chǎn)菌 株假絲酵母的總RNA，具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。得到的總RNA再經(jīng)過文庫構(gòu)建、轉(zhuǎn) 錄組測序及表達(dá)量分析。通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)CandidaA07204和Candida06446這對 等位基因轉(zhuǎn)錄水平分別為3338. 5和4333. 2RPKM。這里，RPKM是基因表達(dá)量的一個計算方 法，表不Reads Per Kb Per Million Reads。其計算公式為
[0040] 設(shè)RPKM(A)為基因 A的表達(dá)量，則C為唯一比對到基因 A的reads數(shù)，N為唯一比 對到參考基因的總reads數(shù)，L為基因 A編碼區(qū)的堿基數(shù)。RPKM法能消除基因長度和測序 量差異對計算基因表達(dá)的影響，計算得到的基因表達(dá)量可以直接用于比較基因表達(dá)差異。
[0041] 由于β -氧化是長鏈二元酸降解相關(guān)的代謝途徑，菌種改造的目的是盡量避免二 元酸降解的發(fā)生。但是另一方面β-氧化對于菌體正常生理代謝和能量供應(yīng)是必需的。 因此，希望通過基因工程的手段來抑制而不是完全阻斷β -氧化，達(dá)到既不影響菌體正常 生長和長鏈二元酸的合成，又避免合成的長鏈二元酸被降解的目的。CandidaA07204和 Candida06446是二倍體DC12的一對等位基因，編碼F0X2蛋白，在二元酸降解過程中負(fù)責(zé) β -氧化代謝中間體的跨膜運(yùn)輸。因此，利用代謝工程手段，敲除該對等位基因其中的一個 拷貝，使得β -氧化代謝中間體在過氧化物酶體內(nèi)積累，通過反饋抑制以達(dá)到抑制二元酸 降解的功效，從而達(dá)到更加有效累積二元酸的目的。
[0042] 3)基因敲除實(shí)驗(yàn)流程如圖3所示。引物設(shè)計原則，同源臂和檢測引物的設(shè)計都選 擇在Candi daA07204和Candi da06446的比對中完全相同的區(qū)域，從而達(dá)到兩個等位基因敲 除和檢測具有同等的概率。在長引物F0X2-F和F0X2-R的5'端為同源臂序列，對應(yīng)于基因 敲除位點(diǎn)的上游和下游序列。這兩個長引物的3'端分別與敲除模塊（deletion cassette) 的上游和下游配對。PCR擴(kuò)增后得到的DNA片段，兩頭分別帶上下游同源臂，中間為抗性篩 選標(biāo)記。
[0043] 擴(kuò)增的DNA片段經(jīng)純化后進(jìn)行電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入菌體細(xì)胞內(nèi)，DNA片段的上下游同源臂 與菌體染色體上的靶位點(diǎn)發(fā)生雙交換，達(dá)到基因敲除的目的。由于這種雙交換是小概率事 件，需要建立方法來進(jìn)行篩選。這里所使用到的抗性基因是Satl，編碼諾爾斯菌素乙酰轉(zhuǎn) 移酶。二元酸生產(chǎn)菌株對諾爾斯菌素（又叫clonNAT或NTC)這種藥物敏感，在含諾爾斯菌 素的平板上不能生長，而表達(dá)該酶后菌體能夠分解諾爾斯菌素，避免致死效應(yīng)。抗性篩選標(biāo) 記只有整合到染色體上去才能得到表達(dá)，發(fā)揮作用，使得菌體能夠在含抗性的培養(yǎng)基平板 上生長，并形成菌落。同時對具有抗性的菌落，進(jìn)行純化和驗(yàn)證。
[0044] 驗(yàn)證時，使用到一對檢測引物F0X2-U和F0X2-D，分別與靶位點(diǎn)的上游和下游區(qū)域 配對。如果沒有同源重組發(fā)生，通過這一對等位基因?yàn)槟０鏀U(kuò)增出來的片段在長度上是一 樣的，在瓊脂糖電泳中只能觀察到一條帶。如果其中一個等位基因由于雙交換事件被抗性 基因片段替換了，那么經(jīng)過擴(kuò)增得到的片段長度就發(fā)生變化，在瓊脂糖電泳中可以觀察到 兩條帶。經(jīng)過驗(yàn)證的菌株，再通過發(fā)酵實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證代謝工程改造獲得新菌株在二元酸生產(chǎn)方 面是否有性能上的優(yōu)勢。
[0045] 4) PCR 擴(kuò)增
[0048] 其中，質(zhì)粒pSFS2,參考文獻(xiàn)為Gene(2004)341:119 - 127，GeneBank數(shù)據(jù)庫的登錄 號為：AY524979,來源于中國科學(xué)院微生物所。
[0049] PCR擴(kuò)增所用引物為F0X2-F和F0X2-R。DNA聚合酶是寶生物工程有限公司的 Pyrobest DNA聚合酶，或者是NEB公司的Phusion DNA聚合酶，活性單位均為5U/ μ 1。
[0050] PCR循環(huán)條件為：
[0051] 94度2分鐘 （預(yù)變性階段）
[0052] 94度20秒，58度20秒，72度1~6分鐘（30個循環(huán)擴(kuò)增階段）
[0053] 72度10分鐘 （最后延伸階段）
[0054] 5) DNA 純化
[0055] 反應(yīng)結(jié)束后，取5 μ 1上述PCR樣品進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測，證明擴(kuò)增所得的DNA片 段大小與預(yù)計的一樣，而且沒有雜帶，進(jìn)行兩步純化和濃縮，為后面的轉(zhuǎn)化準(zhǔn)備DNA樣品。
[0056] 第一步是利用PCR純化試劑盒（購自O(shè)mega公司），按照說明書進(jìn)行。一般是50 μ 1 體系，做4管，總體積共200 μ 1，PCR純化的最后一步用50或100 μ I TE緩沖液洗脫柱子。 純化后的DNA，用NanoDrop儀器測濃度，計算得到的DNA總量約為20 μ g。
[0057] 第二步是將純化的DNA再用乙醇/醋酸鈉/糖原處理進(jìn)行沉淀。具體做法是：往