上述溶在TE緩沖液的DNA溶液加入1 μ 1糖原（20mg/ml)、100 μ 1醋酸鈉（3M，ρΗ5· 2)和 Iml預(yù)冷的無水乙醇；放置-80攝氏度冰箱冷卻30分鐘；4度離心機，14000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速 下，離心10分鐘，留沉淀；沉淀再用75%預(yù)冷的乙醇洗兩遍；超凈臺里風干；4攝氏度冰箱 儲存，電轉(zhuǎn)之前重懸在10 μ 1超純水備用。
[0058] 6)感受態(tài)制備及電轉(zhuǎn)
[0059] 從新鮮活化的平板上挑出發(fā)菌株（Candida sp. DC12,參見《微生物學報》20 (1): 88-93, 1980,正烷烴發(fā)酵生產(chǎn)長鏈混合二羧酸，可從中國科學院微生物所購買）的單菌 落于3ml液體YH)培養(yǎng)基中，30 °C搖床培養(yǎng)過夜，轉(zhuǎn)速為220轉(zhuǎn)/分鐘；2 %轉(zhuǎn)接于20ml YPD，30°C搖床培養(yǎng)，220轉(zhuǎn)/分鐘，至0D600達到1. 8 ;將菌液置于冰上靜置15分鐘，使其 停止生長，4000轉(zhuǎn)/分鐘，4°C離心3分鐘，留菌體沉淀；用4ml預(yù)冷無菌水洗一次；4000轉(zhuǎn) /分鐘，4°C離心3分鐘，留菌體沉淀；加入4ml TE/0.1 M LiOAc, 150轉(zhuǎn)/分鐘，30°C的搖床內(nèi) 振蕩90分鐘；加入0.1 mllM DTT，繼續(xù)150轉(zhuǎn)/分鐘、30°C的搖床箱內(nèi)振蕩30分鐘；4000轉(zhuǎn) /分鐘，4°C離心3分鐘，留菌體沉淀；加入4ml預(yù)冷無菌水，洗3次；加入2mlIM山梨醇，洗1 次，4000轉(zhuǎn)/分鐘，4°C離心3分鐘；棄上清，加入120 μ 1山梨醇將細胞懸起；取出40ul的細 胞懸液于I. 5ml離心管，加入5 μ 1上述純化后重懸在無菌水的PCR擴增產(chǎn)物（約10 μ g)， 混勻，置于冰上5分鐘；轉(zhuǎn)入預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中，擦干電轉(zhuǎn)杯，進行電轉(zhuǎn)（電轉(zhuǎn)條件為：2mm狹 縫的電轉(zhuǎn)杯，電壓為1800伏，電擊時間為5毫秒）；電轉(zhuǎn)后立刻加入1ml山梨醇，混勻后吸 出放到1.5ml的離心管中；4000轉(zhuǎn)/分鐘離心3分鐘，棄上清，加入1ml YH)培養(yǎng)基，37°C 的搖床內(nèi)培養(yǎng)2小時；4000轉(zhuǎn)/分鐘離心3分鐘，棄上清，加100 μ I YPD重懸菌體，涂布平 板（YPD+clonNAT)，放到30°C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至單菌落出現(xiàn)。
[0060] 7)篩選抗性菌落
[0061] 將上述抗性平板上長出的單菌落分別接種到Iml YH)培養(yǎng)基的離心管中，加 clonNAT至終濃度為100 μ g/ml，220轉(zhuǎn)/分鐘，30°C搖床培養(yǎng)。出現(xiàn)生長，說明帶有抗性，證 明抗性基因已經(jīng)整合到菌體基因組中并發(fā)揮作用，這部分菌落用于下一步驗證。沒有出現(xiàn) 生長的菌落，說明是假陽性，等同于出發(fā)菌株，停止處理。
[0062] 8)鑒定
[0063] 上面出現(xiàn)生長的抗性菌落，接種YH)液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，吸取500 μ 1菌液，利用 寶生物工程有限公司的基因組提取試劑盒制備基因組DNA，具體操作按照試劑盒說明書進 行。以獲得的基因組DNA為模版，F(xiàn)0X2-U和F0X2-D為引物進行PCR擴增，具體反應(yīng)體系及 反應(yīng)條件參照本實施例1的第4)條。如果靶位點上的等位基因沒有被敲除，從兩條等位染 色體上擴增出來的DNA片段大小一樣，在瓊脂糖電泳上表現(xiàn)為一條帶。如果靶位點上其中 一個等位基因被敲除，從兩條等位染色體上擴增出來的DNA片段大小不一樣，在瓊脂糖電 泳上表現(xiàn)為兩條帶（見圖3)。鑒定為抗性陽性并且靶位點被敲除的菌液，再進一步經(jīng)菌落 純化和相同方法的鑒定，得到本發(fā)明的長鏈二元酸生產(chǎn)菌株TDTC023。
[0064] 實施例2 :長鏈二元酸的發(fā)酵生產(chǎn)
[0065] 菌種通過常規(guī)的斜面培養(yǎng)后，接入50ml -級種子培養(yǎng)16小時，然后將一級種子培 養(yǎng)轉(zhuǎn)接入500ml二級種子培養(yǎng)16小時。
[0066] 種子培養(yǎng)基的配方：酵母膏1~8g/L，玉米衆(zhòng)1~8g/L，鹿糖5~25g/L， KH2P044~12g/L，尿素 (λ 5~4g/L，重蠟40~70g/L，121°C滅菌30分鐘。其中，蔗糖和尿 素分開單獨ll〇°C滅菌20分鐘，滅菌后再合并混勻。
[0067] 二級種子發(fā)酵完成后，轉(zhuǎn)接入5L發(fā)酵罐。發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方：酵母膏1~Sg/ L，玉米衆(zhòng) 1 ~8g/L，鹿糖 5 ~30g/L，KH2P044 ~15g/L，尿素 0· 5 ~4g/L，KN035 ~15g/L， NaClO. 5~2. 5g/L，121°C滅菌30分鐘。其中，蔗糖和尿素分開單獨滅菌，IKTC滅菌20分 鐘，滅菌后再合并混勻。另外配制75 %葡萄糖溶液，105°C滅菌20分鐘，發(fā)酵初期進行流加。 基礎(chǔ)培養(yǎng)基為4L。在30°C以1 :0. 5的通氣體積，控制pH5. 5~6. 5,在第16小時后開始以 50ml/h的速度流加十二碳直鏈烷烴，發(fā)酵時間為144-156小時。整個發(fā)酵過程用IOM NaOH 溶液自動流加控制pH，同時通過轉(zhuǎn)速的調(diào)整使溶解氧保持在30%。
[0068] 如圖4和圖5所示，HPLC分析表明出發(fā)菌株DC12和改造菌株TDTC023發(fā)酵得到 的長鏈二元酸產(chǎn)物一致，純度在98%以上。
[0069] 從下表可以看出，改造后的菌株，轉(zhuǎn)化率也得到提高。
[0072] 實施例3
[0073] 按照實施例2的方法，只是底物從十二碳直鏈烷烴改為月桂酸甲酯。
[0075] 實施例4
[0076] 按照實施例2的方法，只是底物從十二碳直鏈烷烴改為月桂酸乙酯。
【主權(quán)項】
1. 一種長鏈二元酸生產(chǎn)菌株，其分類命名為假絲酵母菌（Candida sp.)TDTC023,其保 藏編號為：CGMCC No. 8929。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的長鏈二元酸生產(chǎn)菌株，其特征在于所述假絲酵母菌的等位基 因CandidaA07204和CandidaA06446之一被敲除，所述等位基因的堿基序列如序列表的序 列5和序列6所示。3. 如權(quán)利要求1所述的長鏈二元酸生產(chǎn)菌株的制備方法，其特征在于包括如下步驟： (1) 準備引物 F0X2-F 和 F0X2-R ; (2) 準備長鏈二元酸生產(chǎn)菌株感受態(tài)細胞； (3) 使用步驟（1)中的引物進行擴增clonNAT抗性基因，利用擴增的產(chǎn)物對菌種中的等 位基因CandidaA07204和CandidaA06446之一進行敲除，所述等位基因的堿基序列如序列 表的序列5和序列6所示； (4) 通過PCR擴增、純化、電轉(zhuǎn)、篩選、鑒定，得到本發(fā)明的長鏈二元酸生產(chǎn)菌株。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的長鏈二元酸生產(chǎn)菌株的制備方法，其特征在于所述篩選步驟 中使用的篩選標記為clonNAT。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的長鏈二元酸生產(chǎn)菌株的制備方法，其特征在于所述步驟（2) 中的長鏈二元酸生產(chǎn)菌株為假絲酵母（Candida sp.)DC12。6. 如權(quán)利要求1所述的長鏈二元酸生產(chǎn)菌株在生產(chǎn)長鏈二元酸中的應(yīng)用。7. 如權(quán)利要求6所述的長鏈二元酸生產(chǎn)菌株在生產(chǎn)長鏈二元酸中的應(yīng)用，其特征在于 發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液加熱至70~80°C ;再將pH調(diào)至9~9. 5,除去菌體沉淀，保留上清； 脫色，溫度保持在70~90°C，得到濾清液，用酸酸化至pH2. 5, 70~90°C保溫，冷卻，離心或 壓濾，水洗，清洗后的沉淀取出后真空干燥，得到長鏈二元酸。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種長鏈二元酸生產(chǎn)菌株及其制備方法和應(yīng)用，其解決了現(xiàn)有長鏈二元酸菌種改造效果不顯著的技術(shù)問題，其分類命名為假絲酵母菌(Candida？sp.)TDTC023，其保藏編號為：CGMCC？No.8929。本發(fā)明可廣泛用于長鏈二元酸的制備領(lǐng)域。<pb pnum="1" />CGMCC NO892920140318
【IPC分類】C12R1/72, C12N1/19, C12P7/64, C12N15/87
【公開號】CN105018363
【申請?zhí)枴緾N201410176116
【發(fā)明人】賴小勤, 晏禮明, 楊勇, 張子娟, 陳遠童, 陶勇, 傅深展
【申請人】中國科學院微生物研究所
【公開日】2015年11月4日
【申請日】2014年4月28日