一種雜合tRNA及其在制備谷胱甘肽過氧化物酶中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種雜合tRNA及其在制備高活力含硒谷胱 甘肽過氧化物酶中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 含硒谷胱甘肽過氧化物酶（GPX)的底物是谷胱甘肽（GSH)，催化基團(tuán)是硒代半胱 氨酸（Sec)。在生物體內(nèi)，GPX同超氧化物歧化酶（SOD)、過氧化氫酶（CAT) -起構(gòu)成了機 體抗氧化防御體系。GPX在該體系中發(fā)揮著重要的作用，它以底物GSH為還原劑，分解體內(nèi) 的過氧化氫和各類氫過氧化物，因而能清除體內(nèi)活性氧（ROS)，防止脂質(zhì)過氧化，治療由活 性氧引起的各種疾病，如衰老、紫外線輻射、心腦血管疾病、糖尿病、腫瘤等。與其它抗氧化 酶不同，GPX除了能清除ROS外，還能降解脂質(zhì)過氧化物，防止細(xì)胞過氧化損傷，這種獨特的 保護(hù)細(xì)胞的功能使它在抗氧化酶體系中占有特別重要的位置。然而，由于天然GPX的來源 相當(dāng)有限、穩(wěn)定性差，致使它的人工產(chǎn)物及其模擬物的研究備受關(guān)注。
[0003] 小分子模擬物主要有PZ51 (ebselen)、AL3823A、BXT系列產(chǎn)品，它們的弱點是活力 低，僅為天然GPX的千分之一左右。大分子的模擬物主要有抗體酶（中國專利94102481. 4 和96112628.0)和以谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（GST)為蛋白模板制備的GPX模擬酶，其活力顯著 高于小分子模擬物。顯然，以具有谷胱甘肽（GSH)結(jié)合部位的蛋白為模板制備的大分子GPX 模擬酶收到了更好的效果，因此開發(fā)制備這些高活力的GPX模擬酶制備技術(shù)就成了學(xué)術(shù)界 的研究熱點，對于分子生物學(xué)、生物工程學(xué)及醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。迄今已成功 開發(fā)的方法有：用化學(xué)法（中國專利94102481. 4,96112628. 0)或營養(yǎng)缺陷型原核表達(dá)系 統(tǒng)（中國專利200810050556. 6)在非GPX類模板蛋白中引入GPX的催化基團(tuán)硒代半胱氨酸 (Sec)〇
[0004] 中國專利 94102481. 4,96112628. 0,99104234. 4,200810050556. 6 公開的各類含 硒抗體酶的制備方法就是應(yīng)用化學(xué)突變（修飾）法在抗體類模板蛋白中引入GPX的催化基 團(tuán)Sec，有以下缺點：（1)在制備過程中，僅化學(xué)突變（修飾）這一步就會損失20-40%的酶 蛋白，導(dǎo)致模擬酶產(chǎn)率顯著下降；（2)制備模擬酶的周期長，操作繁瑣，時間長；（3)在化學(xué) 突變過程中需使用苯甲基磺酰氟、乙腈等，這些物質(zhì)為有毒性的物質(zhì)；(4)缺乏靶向性，對 于大的蛋白分子而言，一次化學(xué)反應(yīng)常在不同位點引入多個非特異性催化基團(tuán)，因此化學(xué) 突變引入催化基團(tuán)無法達(dá)到基因突變法那樣的專一性。
[0005] 中國專利200810050556. 6也公開了人源單鏈含硒抗體酶的另一種制備方法是用 營養(yǎng)缺陷型原核表達(dá)系統(tǒng)（大腸桿菌）和基因突變法引入催化基團(tuán)，但其僅限于人源單鏈 含硒抗體酶的制備，不包括谷胱甘肽過氧化物酶（GPX)突變體及其它GPX模擬酶的制備 方法。具有GPX活性的谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（GST)的制備方法（Yu，H.J.，Liu，J.Q.， A.，Li, J.，Luo, G. Μ·，and Shen, J. C. J. Biol. Chem. 2005, 280, 11930-11935)亦見報道，這種 方法雖然也采用營養(yǎng)缺陷型原核表達(dá)系統(tǒng)和基因突變法引入催化基團(tuán)，但其僅限于以GST 為模板蛋白制備GPX模擬酶，不包括以天然GPX為模板制備GPX突變體。用營養(yǎng)缺陷型原 核表達(dá)系統(tǒng)在非GPX類模板蛋白中引入催化基團(tuán)制備模擬酶的方法是將催化基團(tuán)引入到 與GPX有相同底物GSH結(jié)合部位的它種蛋白中使其產(chǎn)生GPX活力。
[0006] 然而由于這些模板蛋白不具備天然GPX自身的催化基團(tuán)，因此很難找到理想而準(zhǔn) 確的催化基團(tuán)的位置；同時由于這些模板蛋白中也沒有象天然GPX那樣理想的催化三聯(lián) 體，因此這類模擬酶的催化效率不高。如果以天然GPX為模板用基因工程方法來制備GPX 則可克服這些缺點。由于編碼GPX的催化基團(tuán)Sec的密碼子UGA是終止密碼子，在普通原 核表達(dá)系統(tǒng)中，需先在GPX基因的開放閱讀框內(nèi)、緊鄰Sec的密碼子UGA下游引入頸環(huán)結(jié) 構(gòu)，再通過Sec特異tRNA即SelC和一系列順式元件和反式作用因子共同參與的復(fù)雜過程 將UGA翻譯成Sec而不是終止密碼子。開放閱讀框內(nèi)頸環(huán)的引入必然會引起GPX空間構(gòu)象 的改變，進(jìn)而影響酶活性，此外，這種翻譯機制的通讀效率非常低，最高僅為20種常規(guī)氨基 酸的5%。因此普通原核表達(dá)系統(tǒng)不適于直接表達(dá)具有GPX活性的含硒蛋白。
[0007] 中國專利201310302778. 3和2013101428661公開的方法取得了突破性進(jìn)展，但其 只能用于制備高活力的各型GPX突變體，不能用于制備天然GPX蛋白。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于提供一種人工合成的能通讀UAG為硒代半胱氨酸的雜合tRNA 及其在制備高活力含硒谷胱甘肽過氧化物酶中的應(yīng)用。
[0009] 應(yīng)用基因工程技術(shù)、原核細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，以基因組中所有UAG終止密碼子被UAA終 止密碼子替代及刪除釋放因子RF 1的大腸桿菌為表達(dá)系統(tǒng)，利用人工合成的雜合tRNA編 碼UAG終止密碼子為硒代半胱氨酸（硒代半胱氨酸），從而通過常規(guī)氨基酸進(jìn)入肽鏈的方式 實現(xiàn)硒代半胱氨酸在谷胱甘肽過氧化物酶（GPX)的活性中心定點插入和高活力GPX的高效 表達(dá)。本方法可以在避開原核生物編碼硒代半胱氨酸的復(fù)雜機制及低效率等缺點，發(fā)揮原 核生物便于基因操作、高效表達(dá)外源基因和培養(yǎng)成本低等優(yōu)點，為GPX等具有藥用價值的 硒蛋白提供簡單、高效的制備方法。本發(fā)明方法在生物制藥方面具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0010] 本發(fā)明以大腸桿菌絲氨酸的tRNA的編碼序列SerT (參見NCBI，Gene ID:944826， 編碼tRNASCTU(；A)和硒代半胱氨酸的tRNA編碼序列SelC(參見NCBI，Gene ID:948167,編 碼tRNAsec)為模板，通過計算機輔助的序列分析和基因合成，得到一種能夠編碼琥珀型 終止密碼子UAG為硒代半胱氨酸的雜合tRNA UAeuA，其由90個堿基組成，與大腸桿菌tRNAs% 相比較，其既能夠作為硒代半胱氨酸合成的底物tRNA，又能夠被大腸桿菌自身的延伸因子 EF-Tu識別，從而通過常規(guī)氨基酸進(jìn)入肽鏈的方式實現(xiàn)硒代半胱氨酸在UAG密碼子處的定 點編碼與插入。利用此雜合tRNA在UAG通讀表達(dá)系統(tǒng)中能高效表達(dá)高活力具有天然氨基 酸序列的GPX，所述的雜合tRNA UAeuA的一級核苷酸序列（SEQ ID N〇:l)如下所示：
[0011] SEQ ID No: 1
[0012] GGAAGAUGUGGCCGAGCGGUUGAAGGCACCG⑶CUCUAAAACCGGCGACCCGAAAGGGUUCGCAGGUUC GAAUCC腳CAUCUUCCGCCA
[0013] 進(jìn)一步，所述的雜合tRNA的具體核苷酸序列還包括將序列I (SEQ ID No: 1)第72 位堿基A突變?yōu)槠渌N堿基C、U、G中的任何一個所形成的新型雜合tRNA，其序列為SEQ ID No:2、3、4〇
[0014] SEQ ID No:2
[0015] GGAAGAUGUGGCCGAGCGGUUGAAGGCACCG⑶CUCUAAAACCGGCGACCCGAAAGGGUUCGCAGGUUC GACUCC腳CAUCUUCCGCCA
[0016] SEQ ID No:3
[0017] GGAAGAUGUGGCCGAGCGGUUGAAGGCACCG⑶CUCUAAAACCGGCGACCCGAAAGGGUUCGCAGGUUC GAUUCC腳CAUCUUCCGCCA
[0018] SEQ ID No:4
[0019] GGAAGAUGUGGCCGAGCGGUUGAAGGCACCG⑶CUCUAAAACCGGCGACCCGAAAGGGUUCGCAGGUUC GA ⑶ CC 腳 CAUCUUCCGCCA
[0020] 進(jìn)一步，所述的雜合tRNA的具體堿基序列還包括，將序列1-4(SEQ ID No: 1、2、3、 4)中第8位堿基G突變?yōu)镃、第79位堿基C突變?yōu)镚所形成的任何一種新型雜合tRNA，其 序列為 SEQ ID No:5、6、7、8。
[0021] SEQ ID No:5
[0022] GGAAGAUCUGGCCGAGCGGUUGAAGGCACCG⑶CUCUAAAACCGGCGACCCGAAAGGGUUCGCAGGUUC GAAUCC腳GAUCUUCCGCCA
[0023] SEQ ID No:6
[0024] GGAAGAUCUGGCCGAGCGGUUGAAGGCACCG⑶CUCUAAAACCGGCGACCCGAAAGGGUUCGCAGGUUC GACUCC腳GAUCUUCCGCCA
[0025] SEQ ID No:7
[0026] GGAAGAUCUGGCCGAGCGGUUGAAGGCACCG⑶CUCUAAAACCGGCGACCCGAAAGGGUUCGCAGGUUC GAUUCC腳GAUCUUCCGCCA
[0027] SEQ ID No:8
[0028] GGAAGAUCUGGCCGAGCGGUUGAAGGCACCG⑶CUCUAAAACCGGCGACCCGAAAGGGUUCGCAGGUUC GA ⑶ CC 腳 GAUCUUCCGCCA
[0029] 進(jìn)一步，所述的雜合tRNA的具體堿基序列還包括，將序列1-8 (SEQ ID No: 1、2、3、 4、5、6、7、8)中第62位堿基G突變?yōu)閁、第78位堿基U突變?yōu)锳和第64位堿基A突變?yōu)镃、 第76位堿基U突變?yōu)镚所形成的任何一種新型雜合tRNA，其序列可以是SEQ ID N〇:9、10、 11、12、13、14、15、16〇
[0030] SEQ ID No:9
[0031] GGAAGAUGUGGCCGAGCGGUUGAAGGCACCG⑶CUCUAAAACCGGCGACCCGAAAGGGUUCUCCGGUUC GAAUCCGGACAUCUUCCGCCA
[0032] SEQ ID No: 10
[0033] GGAAGAUGUGGCCGAGCGGUUGAAGGCACCG⑶CUCUAAAACC