成的DNA 序列；
[0063] 2)、陽性轉(zhuǎn)化子的篩選及蛋白的表達(dá)與純化：
[0064] 用步驟1)中構(gòu)建的含有雜合tRNA基因的和編碼序列中含TAG的目的基因的表達(dá) 載體轉(zhuǎn)化UAG通讀工程菌-C321. Δ A. exp (Addgene Cat. #49018)的感受態(tài)細(xì)胞，涂含氨芐 抗性的營養(yǎng)瓊脂平板，篩選陽性菌株；將陽性轉(zhuǎn)化子擴大培養(yǎng)后，在含有亞硒酸鈉的營養(yǎng)瓊 脂培養(yǎng)基中，經(jīng)IPTG低溫4-25°C誘導(dǎo)表達(dá)，UAG通讀工程菌無法終止UAG密碼子，在雜合 tRNA的識別下，將UAG編碼為硒代半胱氨酸，直接表達(dá)出在底物GSH的結(jié)合部位含有硒代半 胱氨酸的GPX，酶蛋白以可溶性形式表達(dá)并分泌到菌體的周質(zhì)腔里；抗性篩選獲得的菌株 經(jīng)37°C擴大培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)至4-25Γ誘導(dǎo)表達(dá)；收集、洗滌、冰浴下超聲破碎菌體、釋放酶蛋白， 將液體低溫離心，去除菌體沉淀、獲得上清液；用谷胱甘肽（GSH)親和層析純化GPX蛋白，透 析凍干后即得GPX蛋白純品。用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE)和蛋白印跡（Western blot)鑒定目標(biāo)蛋白。
[0065] 該方法在UAG通讀原核表達(dá)系統(tǒng)中，通過雜合tRNA攜帶Sec到UAG密碼子處，在 重組GPX的底物結(jié)合部位引入了催化基團，因而產(chǎn)生高活力的GPX蛋白。
[0066] 所述的用谷胱甘肽（GSH)親和層析純化GPX蛋白，是用pH7. 5, 50mmol/L Tris-Cl 平衡并洗脫雜蛋白，用含lOmmol/L GSH的緩沖液洗脫目的蛋白。
[0067] 所述的將液體低溫離心，可以在4°C，8000-12000g離心15-30min。
[0068] 本發(fā)明具有以下特點：
[0069] (1)本發(fā)明使用簡單的基因合成或擴增、基因突變和原核表達(dá)等基因工程技術(shù)，實 現(xiàn)了與20種常規(guī)氨基酸相同的方式將硒代半胱氨酸插入到GPX的活性部位，制備方法簡 單，解決了天然GPX來源有限、制備困難這一難題。
[0070] (2)本發(fā)明方法制備的GPX蛋白活力高，且組成序列與天然GPX完全相同，用于人 體不會發(fā)生免疫或排斥反應(yīng)，細(xì)胞生物學(xué)實驗已證實對過氧化氫損傷的心肌細(xì)胞有更強的 保護作用。
[0071] (3)本發(fā)明所述的GPX的抗氧化活力顯著高于以往報道的GPX突變體的活力。
[0072] (4)本發(fā)明使用的分泌型表達(dá)載體，能將GPX蛋白以可溶性形式表達(dá)并分泌到大 腸桿菌的周質(zhì)腔，引導(dǎo)蛋白分泌表達(dá)的前導(dǎo)信號肽由菌體自動切除，所表達(dá)的蛋白為可溶 性，具有天然蛋白的空間構(gòu)象和更高的活性，不需復(fù)性，可避免包涵體復(fù)性過程造成的產(chǎn)率 下降和失活，因而生產(chǎn)周期短。
[0073] (5)本發(fā)明通過新型雜合tRNA與UAG通讀工程菌聯(lián)合應(yīng)用，通過常規(guī)氨基酸進入 肽鏈的方式實現(xiàn)硒代半胱氨酸在UAG密碼子處的定點編碼與插入，從而提高通讀效率和產(chǎn) 率，因此具有高效高產(chǎn)的雙重優(yōu)勢。
[0074] 這些優(yōu)點均有利于大規(guī)模生產(chǎn)，為今后的實際應(yīng)用打下了堅實的基礎(chǔ)，解決了天 然GPX來源不足、性質(zhì)不穩(wěn)定和活力低的問題，在生物制藥方面有廣闊的應(yīng)用前景。
【附圖說明】：
[0075] 圖1 :實施例1-9制備的GPXl的SDS-PAGE和（上）和Western blot (下）結(jié)果： 其中M是蛋白分子量Marker，1-9泳道是實施例1-9制備的靶蛋白。
[0076] 圖 2 :實施例 10-18 制備的 GPXl 的 SDS-PAGE 和（上）和 Western blot (下）結(jié) 果：其中M是蛋白分子量Marker，10-18泳道是實施例10-18制備的靶蛋白。
【具體實施方式】
[0077] 實施例1 :用合成的雜合tRNA序列1和靶基因聯(lián)合UAG通讀原核表達(dá)系統(tǒng)制備基 因工程人GPXl蛋白
[0078] 根據(jù)本發(fā)明序列I (SEQ ID No: 1)所述的tRNA堿基序列，在生物公司用DNA合成 儀人工合成能在UAG通讀工程菌株中表達(dá)序列1(SEQ ID No: 1)所述雜合tRNA的基因，確 保雜合tRNA基因的Y端含有Ipp啟動子序列和ClaI酶切位點，3'端含有rrnc終止子序 列和ClaI酶切位點（序列如下）
[0079] CCATCGATCCCATCAAAAAAATATTCTCAACATAAAAAACTTTGTGTAATACTTGTAACGCTGAATTCG GAAGATGTGGCCGAGCGGTTGAAGGCACCGGTCTCTAAAACCGGCGACCCGAAAGGGTTCGCAGGTTCGAATCCTGT CATCTTCCGCCAGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGATCCTTAGCGAAAGCTAAGGATTTTTTTT ATCGATGG ；
[0080] 用限制性核酸內(nèi)切酶ClaI單酶切雜合tRNA的基因后，連接到同樣用ClaI單酶 切的pCold III載體上（TAKARA，Cat. #3369, ClaI為pCold III多克隆位點以外的單獨 存在酶切位點，在該處插入外源序列不影響載體本身其他功能），所獲得的載體為PCold III-tRNA〇
[0081] 在生物公司用DNA合成儀人工合成能在UAG通讀工程菌株（C321. ΔΑ. exp)中通 讀表達(dá)的GPXl基因，確保其Y端含有起始密碼子（ATG)和EcoR I酶切位點，3'端含有 終止密碼子和Hind III酶切位點，其第49位Sec的編碼序列TGA替換為琥珀型終止密 碼子（TAG)，用限制性核酸內(nèi)切酶EcoR I和Hind III雙酶切后，連接到同樣酶切的pCold ΠΙ-tRNA載體上，構(gòu)建的質(zhì)粒為pCold III-tRNA-GPxl。
[0082] 用裝有雜合tRNA和GPXl基因的載體（pCold III-tRNA-GPxl)轉(zhuǎn)化UAG通讀工程 菌C321. Δ A. exp的感受態(tài)細(xì)胞，涂含有100 μ g/mL Amp的營養(yǎng)瓊脂平板，篩選陽性菌株。 將陽性轉(zhuǎn)化子接種于I. 2L營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（含100 μ g/mL氨芐青霉素和50uM亞硒酸鈉） 中，在37°C空氣浴中160rpm震蕩培養(yǎng)至0D600為0. 5。將菌液置于30°C低溫?fù)u床中80rpm 震蕩培養(yǎng)5h，之后加入終濃度為0. lmmol/L IPTG，30°C振蕩培養(yǎng)5h，使GPXl蛋白以可溶 性形式表達(dá)在菌體的周質(zhì)腔里。收集菌體（6000rpm，10min)并用等體積的緩沖液T(50mM Tris buffer，pH7. 5,含ImM EDTA)洗滌兩次。用緩沖液T重懸菌體沉淀，加入終濃度ImM 的PMSF(苯甲基磺酰氟），超聲破碎菌體，4°C，12000rpm離心30min，收集上清。按說明書處 理GSH親合柱，應(yīng)用緩沖液（50mmol/L Tris，pH7. 5)平衡，將上清液加入GSH親合柱上， 用平衡緩沖液洗脫雜蛋白，用lOmmol/L GSH洗脫目的蛋白。將洗脫液透析并凍干，即得人 GPXl蛋白。用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE)和蛋白印跡（Western blot)鑒定靶 蛋白，其分子量為21. 9kDa，且與抗GPXl抗體特異性結(jié)合，證明成功獲得了目標(biāo)蛋白，見圖1 的第1泳道。其GPX活力為2729lU/umol蛋白，高于以往報道的GPX突變體。
[0083] 實施例 2-16 :
[0084] 用合成的雜合tRNA序列2-16和靶基因聯(lián)合UAG通讀原核表達(dá)系統(tǒng)制備基因工 程人GPXl蛋白。具體方法與實施例1完全相同只是分別根據(jù)本發(fā)明序列2-16(SEQ ID No: 2-16)所述的tRNA堿基序列，在生物公司用DNA合成儀人工合成能在UAG通讀工程菌株 中表達(dá)序列2-16 (SEQ ID No :2-16)所述雜合tRNA的基因，確保雜合tRNA基因的Y端含 有Ipp啟動子序列和ClaI酶切位點，3 ^端含有rrnc終止子序列和ClaI酶切位點，合成的 具體基因序列序列分別是：
[0085] 實施例2合成的能表達(dá)SEQ ID No: 2所述的tRNA堿基序列的基因序列為：
[0086] CCATCGATCCCATCAAAAAAATATTCTCAACATAAAAAACTTTGTGTAATACTTGTAACGCTGAATTCG GAAGATGTGGCCGAGCGGTTGAAGGCACCGGTCTCTAAAACCGGCGACCCGAAAGGGTTCGCAGGTTCGACTCCTGT CATCTTCCGCCAGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGATCCTTAGCGAAAGCTAAGGATTTTTTTT ATCGATGG ；
[0087] 實施例3合成的能表達(dá)SEQ ID No: 3所述的tRNA堿基序列的基因序列為：
[0088] CCATCGATCCCATCAAAAAAATATTCTCAACATAAAAAACTTTGTGTAATACTTGTAACGCTGAATTCG GAAGATGTGGCCGAGCGGTTGAAGGCACCGGTCTCTAAAACCGGCGACCCGAAAGGGTTCGCAGGTTCGATTCCTGT CATCTTCCGCCAGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGATCCTTAGCGAAAGCTAAGGATTTTTTTT ATCGATGG ；
[0089] 實施例4合成的能表達(dá)SEQ ID No: 4所述的tRNA堿基序列的基因序列為：
[0090] CCATCGATCCCATCAAAAAAATATTCTCAACATAAAAAACTTTGTGTAATACTTGTAACGCTGAATTCG GAAGATGTGGCCGAGCGGTTGAAGGCACCGGTCTCTAAAACCGGCGACCCGAAAGGGTTCGCAGGTTCGAGTCCTGT CATCTTCCGCCAGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGATCCTTAGCGAAAGCTAAGGATTTTTTTT ATCGATGG ；
[0091] 實施例5合成的能表達(dá)SEQ ID No:5所述的tRNA堿基序列的基因序列為：
[0092] CCATCGATCCCATCAAAAAAATATTCTCAACATAAAAAACTTTGTGTAATACTTGTAACGCTGAATTCG GAAGATCTGGCCGAGCGGTTGAAGGCACCGGTCTCTAAAACCGGCGACCCGAAAGGGTTCGC