一種確定大豆球蛋白堿性多肽抑菌機制的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及多肽物質(zhì)抑菌機理領(lǐng)域，特別涉及一種確定大豆球蛋白堿性多肽抑菌 機制的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著生活水平的提高，人們對于食品的營養(yǎng)、安全和保鮮要求不斷提高。由于化學(xué) 防腐劑對人體的毒副作用，安全無毒的天然防腐劑越來越成為研究熱點。
[0003] 抗菌肽是一種潛力巨大的天然防腐劑。目前許多研究表明，植物源的水解肽有一 定的抑菌特性。大豆球蛋白堿性多肽是通過斷裂酸性多肽與堿性多肽之間的二硫鍵后，通 過等電點沉淀法從大豆球蛋白中提取所得的多肽。已有研究表明大豆球蛋白堿性多肽具有 比青霉素更高的抗菌特性，能明顯抑制單細(xì)胞李斯特菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的生 長。
[0004] 關(guān)于抗菌肽的抑菌機制，目前普遍認(rèn)為有膜損傷和膜內(nèi)物質(zhì)損傷機制。由于抗菌 肽結(jié)構(gòu)復(fù)雜，作用機制多樣，關(guān)于大豆球蛋白堿性多肽的膜損傷機制，目前還沒有被闡明， 從而嚴(yán)重制約了其在食品防腐中的應(yīng)用。探究大豆球蛋白堿性多肽的膜損傷機制，將大豆 球蛋白堿性多肽充分應(yīng)用到食品防腐中，前景將非常廣泛，市場潛力巨大。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了彌補現(xiàn)有技術(shù)無法確定大豆球蛋白堿性多肽的抑菌機理從而抑制大豆球蛋 白堿性多肽在食品防腐中應(yīng)用的不足，提供一種簡便且準(zhǔn)確的確定大豆球蛋白堿性多肽抑 菌機制的方法。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案為： 一種確定大豆球蛋白堿性多肽抑菌機制的方法，步驟為： A. 檢測大豆球蛋白堿性多肽對微生物細(xì)胞離子泄露的影響情況； B. 檢測大豆球蛋白堿性多肽對微生物細(xì)胞外膜滲透性的影響情況； C. 檢測大豆球蛋白堿性多肽對微生物細(xì)胞內(nèi)膜滲透性的影響情況； D. 結(jié)果判定：若大豆球蛋白堿性多肽促進(jìn)微生物細(xì)胞離子泄露、大豆球蛋白堿性多肽 促使細(xì)胞外膜滲透性增強、大豆球蛋白堿性多肽促使細(xì)胞內(nèi)膜滲透性增強，則大豆球蛋白 堿性多肽的抑菌機制為膜損傷機制；反之為膜內(nèi)物質(zhì)損傷機制。
[0007] 作為優(yōu)選方案，步驟A、B、C、D所述微生物為大腸桿菌。
[0008] 作為優(yōu)選方案，步驟A具體包括： 1) 將對數(shù)生長期10s-109cfu/ml的大腸桿菌菌液離心，收集菌體；將所收集的菌體重懸 于0. 8-0. 9%的無菌生理鹽水中，并將菌懸液平均分成兩組； 2) 向步驟1)兩組菌懸液中的一組中加入大豆球蛋白堿性多肽溶液，設(shè)為實驗組；另一 組中加入等量純凈水，設(shè)為對照組； 3) 將步驟2)兩組樣品在36-38Γ恒溫振蕩培養(yǎng)，每隔半小時從兩組樣品中各自取出菌 液，離心收集上清液； 4) 將步驟3)所收集的上清液置于消化杯中，再分別加入濃硝酸和高氯酸85-95Γ水浴 加熱，重復(fù)多次，直到剩余液體顏色透明為止； 5) 將兩組步驟4)所得透明液體分別用純凈水定容，分別測定各組中Ca2+、K+、Mg2+的濃 度變化。
[0009] 作為優(yōu)選方案，步驟B具體包括： 1) 將紅霉素稀釋至0.7、1.5、3、6、25、10(^8/1111，將利福平稀釋至0.6、1.25、2.5、5、 10、20 μ g/ml ; 2) 將步驟1)所配制不同濃度的紅霉素分別與大腸桿菌菌液和大豆球蛋白堿性多肽混 合均勻，作為實驗組一；步驟1)所配制不同濃度的利福平分別與大腸桿菌菌液和大豆球蛋 白堿性多肽混合均勻，作為實驗組二； 3) 將步驟1)所配制不同濃度的紅霉素分別與大腸桿菌菌液和無菌水混合，作為對照 組一；將步驟1)所配制不同濃度的利福平分別與大腸桿菌菌液和無菌水混合，作為對照組 -* * 4) 將實驗組一、實驗組二、對照組一、對照組二四組溶液在36-38°C恒溫培養(yǎng)3-7h后， 檢測其吸光度。
[0010] 作為優(yōu)選方案，步驟C具體包括： 1) 將對數(shù)生長期10s-109cfu/ml的大腸桿菌菌液離心，收集菌體；將所收集的菌體重懸 于M9乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基中； 2) 將步驟1)所得菌懸液36-38°C振蕩培養(yǎng)8-12h后，離心收集菌體，并將菌體重懸于 β-半乳糖苷酶反應(yīng)緩沖液中； 3) 將大豆球蛋白堿性多肽配制成濃度為50、100、200、400 μ g/ml的溶液； 4) 將步驟2)所得菌懸液分別與鄰硝基苯-β -D-吡喃半乳糖苷以及步驟3)所述不同 濃度的大豆球蛋白堿性多肽溶液混合，36-38Γ持續(xù)水??； 5) 每隔30min，測定步驟4)各溶液的吸光度。
[0011] 作為優(yōu)選方案，步驟A 2)中大豆球蛋白堿性多肽溶液的濃度為300-500 μ g/ml。
[0012] 作為優(yōu)選方案，步驟B 4)中吸光度的測定波長為600nm。
[0013] 作為優(yōu)選方案，步驟C 2)中將菌體重懸于β-半乳糖苷酶反應(yīng)緩沖液中后，菌懸 液在測定波長為600nm時，滿足OD=O. 2 〇
[0014] 作為優(yōu)選方案，步驟C 4)鄰硝基苯-β -D-吡喃半乳糖苷的濃度為lmg/ml。
[0015] 本發(fā)明的有益效果為： 本發(fā)明通過測量細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)金屬離子的泄露，細(xì)胞內(nèi)、外膜的滲透性，，探索了大豆球 蛋白堿性多肽的膜損傷機制，為大豆球蛋白堿性多肽在食品防腐中的應(yīng)用提供了理論依 據(jù)。
[0016] 本發(fā)明方法簡單、可靠。
【具體實施方式】
[0017] 實施例1 大豆球蛋白堿性多肽的膜損傷機制的方法，包括步驟： A.檢測大豆球蛋白堿性多肽對大腸桿菌細(xì)胞離子泄露的影響情況 1)將20ml大腸桿菌菌液(對數(shù)期，10s-109cfu/ml)6500r/min離心15min收集菌體。將 所收集的菌體重懸于20ml無菌生理鹽水（0. 85%)中，然后將菌懸液平均分成兩組。
[0018] 2)向步驟1)兩組菌懸液中的一組中加入大豆球蛋白堿性多肽溶液，使大豆球蛋 白堿性多肽終濃度為400 μ g/ml，設(shè)為實驗組；另一組中加入等量娃哈哈純凈水，設(shè)為對照 組。
[0019] 3)將步驟2)兩組樣品恒溫振蕩（37°C)培養(yǎng)，每隔半小時從兩組樣品中各自取出 6ml菌液，6500r/min離心15min，收集上清液。
[0020] 4)將步驟3)所收集的上清液置于消化杯中，再分別加入5ml濃硝酸和Iml高氯 酸，90°C水浴加熱到剩余Iml液體，重復(fù)多次，直到剩余的Iml液體顏色透明為止。
[0021] 5)將兩組步驟4)所得的Iml透明液體分別用娃哈哈純凈水定容至25ml，用電感 耦合等離子體發(fā)射光譜儀分別測定各組中Ca 2+、K+、Mg2+的濃度變化，結(jié)果如表1示，與對照 組相比，實驗組Ca 2+、K+、Mg2+泄露明顯增加。并且隨著時間的增加 ，Ca 2+、K+、Mg2+的泄露濃 度逐漸增加，說明大豆球蛋白堿性多肽能通過破壞細(xì)胞膜而引起離子的泄露。
[0022] 表1大豆球蛋白堿性多肽對大腸桿菌細(xì)胞離子泄露的影響情況
Β.檢測大豆球蛋白堿性多肽對大腸桿菌細(xì)胞外膜滲透性的影響情況 1) 將紅霉素稀釋至0.7、1.5、3、6、25、10(^8/1111，將利福平稀釋至0.6、1.25、2.5、5、 10、20 μ g/ml ; 2) 將步驟1)所配制不同濃度的紅霉素各5ml