分別與5ml大腸桿菌菌液和250 μ 1大豆 球蛋白堿性多肽（80 μ g/ml)混合均勻，作為實驗組一；步驟1)所配制不同濃度的利福平各 5ml分別與5ml大腸桿菌菌液和250 μ 1大豆球蛋白堿性多肽（80 μ g/ml)混合均勾，作為實 驗組二； 3) 將步驟1)所配制不同濃度的紅霉素5ml分別與5ml大腸桿菌菌液和250 μ 1無菌水 混合，作為對照組一；將步驟1)所配制不同濃度的利福平各5ml分別與5ml大腸桿菌菌液 和250 μ 1無菌水混合，作為對照組二； 4) 將實驗組一、實驗組二、對照組一、對照組二四組溶液在37°C恒溫培養(yǎng)5h后，檢測其 吸光度。
[0023] 在600nm波長下用紫外分光光度計檢測其吸光值變化如表2、表3所示，加大豆球 蛋白堿性多肽組OD值明顯比單獨的紅霉素、利福平組OD值低，說明大豆球蛋白堿性多肽能 明顯增加外膜的通透性，進而增加紅霉素和利福平對大腸桿菌的敏感性。
[0024] 表2大豆球蛋白堿性多肽對大腸桿菌細胞外膜滲透性的影響情況一
[0025] C.檢測大豆球蛋白堿性多肽對微生物細胞內(nèi)膜滲透性的影響情況 1) 將對數(shù)生長期l〇S-l〇9cfu/ml的大腸桿菌菌液離心，收集菌體；將所收集的菌體重懸 于100 mL M9乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基中； 2) 將步驟1)所得菌懸液37°C振蕩培養(yǎng)IOh后，6500r/min離心15min，收集菌體，并將 菌體重懸于β -半乳糖苷酶反應(yīng)緩沖液中，使OD=O. 2 ( λ =630nm); 3) 將大豆球蛋白堿性多肽配制成濃度為50、100、200、400 μ g/ml的溶液； 4) 將4ml步驟2)所得菌懸液分別與0. 5ml鄰硝基苯-β -D-吡喃半乳糖苷（lmg/ml) 以及0. 5ml步驟3)所述不同濃度的大豆球蛋白堿性多肽溶液混合，37°C持續(xù)水?。?5) 每隔30min，415nm波長處測定步驟4)各溶液的吸光度，并標(biāo)記為0Dt。吸光值 0D=0D t-0D。的變化表明大腸桿菌細胞內(nèi)膜滲透性的變化。如表4所示，隨著時間的增加，不 同濃度的大豆球蛋白堿性多肽都能明顯增加大腸桿菌內(nèi)膜的通透性，且大豆球蛋白堿性多 肽濃度越高，內(nèi)膜通透性越大。
[0026] 表4大豆球蛋白堿性多肽對微生物細胞內(nèi)膜滲透性的影響情況
[0027] D.結(jié)果判定：大豆球蛋白堿性多肽促進微生物細胞離子泄露、大豆球蛋白堿性多 肽促使細胞外膜滲透性增強、大豆球蛋白堿性多肽促使細胞內(nèi)膜滲透性增強，綜合以上試 驗可確定，大豆球蛋白堿性多肽抑菌機制為膜損傷機制。
【主權(quán)項】
1. 一種確定大豆球蛋白堿性多肽抑菌機制的方法，其特征在于，步驟為： A. 檢測大豆球蛋白堿性多肽對微生物細胞離子泄露的影響情況； B. 檢測大豆球蛋白堿性多肽對微生物細胞外膜滲透性的影響情況； C. 檢測大豆球蛋白堿性多肽對微生物細胞內(nèi)膜滲透性的影響情況； D. 結(jié)果判定：若大豆球蛋白堿性多肽促進微生物細胞離子泄露、大豆球蛋白堿性多肽 促使細胞外膜滲透性增強、大豆球蛋白堿性多肽促使細胞內(nèi)膜滲透性增強，則大豆球蛋白 堿性多肽的抑菌機制為膜損傷機制；反之為膜內(nèi)物質(zhì)損傷機制。2. 如權(quán)利要求1所述確定大豆球蛋白堿性多肽抑菌機制的方法，其特征在于：步驟A、 B、C、D所述微生物為大腸桿菌。3. 如權(quán)利要求2確定大豆球蛋白堿性多肽抑菌機制的方法，其特征在于，步驟A具體包 括： 1) 將對數(shù)生長期l〇s-l〇9Cfu/ml的大腸桿菌菌液離心，收集菌體；將所收集的菌體重懸 于0. 8-0. 9%的無菌生理鹽水中，并將菌懸液平均分成兩組； 2) 向步驟1)兩組菌懸液中的一組中加入大豆球蛋白堿性多肽溶液，設(shè)為實驗組；另一 組中加入等量純凈水，設(shè)為對照組； 3) 將步驟2)兩組樣品在36-38°C恒溫振蕩培養(yǎng)，每隔半小時從兩組樣品中各自取出菌 液，離心收集上清液； 4) 將步驟3)所收集的上清液置于消化杯中，再分別加入濃硝酸和高氯酸85-95°C水浴 加熱，重復(fù)多次，直到剩余液體顏色透明為止； 5) 將兩組步驟4)所得透明液體分別用純凈水定容，分別測定各組中Ca2+、K+、Mg2+的濃 度變化。4. 如權(quán)利要求2確定大豆球蛋白堿性多肽抑菌機制的方法，其特征在于，步驟B具體包 括： 1) 將紅霉素稀釋至〇? 7、1. 5、3、6、25、100y g/ml，將利福平稀釋至0? 6、1. 25、2. 5、5、 10、20 y g/ml ; 2) 將步驟1)所配制不同濃度的紅霉素分別與大腸桿菌菌液和大豆球蛋白堿性多肽混 合均勻，作為實驗組一；步驟1)所配制不同濃度的利福平分別與大腸桿菌菌液和大豆球蛋 白堿性多肽混合均勻，作為實驗組二； 3) 將步驟1)所配制不同濃度的紅霉素分別與大腸桿菌菌液和無菌水混合，作為對照 組一；將步驟1)所配制不同濃度的利福平分別與大腸桿菌菌液和無菌水混合，作為對照組 -* * 4) 將實驗組一、實驗組二、對照組一、對照組二四組溶液在36-38°C恒溫培養(yǎng)3-7h后， 檢測其吸光度。5. 如權(quán)利要求2確定大豆球蛋白堿性多肽抑菌機制的方法，其特征在于，步驟C具體包 括： 1) 將對數(shù)生長期l〇s-l〇9Cfu/ml的大腸桿菌菌液離心，收集菌體；將所收集的菌體重懸 于M9乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基中； 2) 將步驟1)所得菌懸液36-38°C振蕩培養(yǎng)8-12h后，離心收集菌體，并將菌體重懸于 P-半乳糖苷酶反應(yīng)緩沖液中； 3) 將大豆球蛋白堿性多肽配制成濃度為50、100、200、400 y g/ml的溶液； 4) 將步驟2)所得菌懸液分別與鄰硝基苯-D-吡喃半乳糖苷以及步驟3)所述不 同濃度的大豆球蛋白堿性多肽溶液混合，36-38°C持續(xù)水浴； 5) 每隔30min，測定步驟4)各溶液的吸光度。6. 如權(quán)利要求3確定大豆球蛋白堿性多肽抑菌機制的方法，其特征在于：步驟A 2)中 大豆球蛋白堿性多肽溶液的濃度為300-500 y g/ml。7. 如權(quán)利要求4確定大豆球蛋白堿性多肽抑菌機制的方法，其特征在于：步驟B 4)中 吸光度的測定波長為600nm。8. 如權(quán)利要求5確定大豆球蛋白堿性多肽抑菌機制的方法，其特征在于：步驟C 2) 中將菌體重懸于0 -半乳糖苷酶反應(yīng)緩沖液中后，菌懸液在測定波長為600nm時，滿足 OD=O. 2 〇9. 如權(quán)利要求5確定大豆球蛋白堿性多肽抑菌機制的方法，其特征在于：步驟C 4)鄰 硝基苯-D-吡喃半乳糖苷的濃度為lmg/ml。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種確定大豆球蛋白堿性多肽抑菌機制的方法，屬于多肽物質(zhì)抑菌機理領(lǐng)域。由于抗菌肽結(jié)構(gòu)復(fù)雜，作用機制多樣，關(guān)于大豆球蛋白堿性多肽的抑菌機制屬于膜損傷機制還是膜內(nèi)物質(zhì)損失機制，目前還沒有被闡明。本發(fā)明通過測量細菌細胞內(nèi)金屬離子的泄露，細胞內(nèi)、外膜的滲透性，對大豆球蛋白堿性多肽的膜損傷機制進行了確定。
【IPC分類】C12Q1/18
【公開號】CN105018568
【申請?zhí)枴緾N201510479790
【發(fā)明人】李迎秋, 孫秀秀, 趙國萍, 何金興, 趙祥忠
【申請人】齊魯工業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年11月4日
【申請日】2015年8月7日