白芍品種檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種植物品種鑒別方法，特別是涉及一種白芍品種檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] ISSR (inter-simple sequence repeat)是 Zietkeiwitcz 等于 1994 年發(fā)展起來的 一種微衛(wèi)星基礎(chǔ)上的分子標記技術(shù)。其基本原理是用錨定的微衛(wèi)星DNA為引物，即在SSR序 列的3'端或5'端加上2-4個隨機核苷酸，在PCR反應(yīng)中，錨定引物可引起特定位點退火， 導(dǎo)致與錨定引物互補的間隔不太大的重復(fù)序列間DNA片段進行PCR擴增。所擴增的inter SSR區(qū)域的多個條帶通過聚丙烯酰胺凝膠電泳得以分辨，而擴增譜帶多為顯性表現(xiàn)。
[0003] 根據(jù)現(xiàn)代分子生物學(xué)研究表明，中藥材（不含礦物藥）的生物種質(zhì)資源多樣性是 由于其基因多態(tài)性導(dǎo)致的結(jié)果，而基因多態(tài)性可在DNA分子標記技術(shù)水平進行檢測，這是 比在形態(tài)、組織和細胞水平上檢測更能代表其變異類型的遺傳標記。ISSR揭示的多態(tài)性較 高，可獲得幾倍于RAPD (Random Amplification Polymorphic DNA，隨機擴增多態(tài)性DNA)的 信息量，精確度幾乎可與RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性片段 長度多態(tài)性）相媲美。
[0004] 白茍（Radix Paeoniae)，別名茍藥，多年生草本，為毛茛科（Ranunculaceae)植物 芍藥（Paeonia IactifloraPall)的去皮干燥根，性微苦，味苦酸。其主要成分為芍藥苷、芍 藥內(nèi)酯苷、氧芍藥苷、苯甲酰芍藥苷，通稱芍藥總苷。具有抗炎、抗病毒、解痙鎮(zhèn)痛、護肝等多 種藥理活性。白芍在我國栽培已有3900多年的歷史，由于其藥理活性強，臨床應(yīng)用廣泛，白 芍長期以來就被作為多種中藥和新藥的主要原料。由于大部分栽培白芍藥材僅經(jīng)過短期引 種和馴化，在傳統(tǒng)的白芍道地藥材中可能存在著一些經(jīng)過多年選擇但未完全純化的地方優(yōu) 良品種。我國的白芍歷來有三大傳統(tǒng)品種，即產(chǎn)區(qū)為安徽亳州的亳白芍、浙江東陽等地的杭 白芍以及四川中江等地的川白芍。另外在山東、陜西和江蘇等地也有白芍產(chǎn)出。道地白芍 療效好，品質(zhì)佳，成為商品白芍的最佳選擇。
[0005] 近年來隨著中藥市場的快速發(fā)展，新的白芍種植基地不斷出現(xiàn)。白芍歷來以亳、 杭、川為道地，據(jù)胡世林等的研究報道，單以芍藥苷含量而論，亳芍、川芍要優(yōu)于杭芍，同時 他發(fā)現(xiàn)山東曹縣產(chǎn)的白芍盡管沒有名氣，但其外觀與以上道地產(chǎn)品類似，芍藥苷含量高達 1.95%，提示該處可能成為新興的道地產(chǎn)區(qū)。白芍藥材來源除了部分來自種植基地外，大量 原藥材仍來自散戶的收購。因此，生產(chǎn)條件的不規(guī)范導(dǎo)致白芍藥材質(zhì)量參差不齊；同時由于 長期的分散種植，目前白芍種質(zhì)遺傳結(jié)構(gòu)、來源不是很清楚，有的來自原產(chǎn)地，有的來自不 同時期的引種品，有的是同地不同種，因此原植物遺傳結(jié)構(gòu)有較大程度的變異，品種間可能 存在相當(dāng)?shù)幕祀s度。有必要從源頭及白芍種質(zhì)資源、種植規(guī)范方面嚴格要求，搞清白芍藥材 的道地性，建立品種質(zhì)量標準，指導(dǎo)GAP (Good Agriculturing Practice，中藥材生產(chǎn)質(zhì)量 管理規(guī)范）標準化生產(chǎn)。
[0006] 而對道地藥材種源的遺傳分析、品種科學(xué)鑒定和標記是解決白芍種植的品種混亂 問題和檢驗原材料市場上存在的品質(zhì)優(yōu)劣的基礎(chǔ)，是保證道地白芍藥材道地性的關(guān)鍵。道 地性白芍和非道地性白芍外觀形態(tài)、質(zhì)地紋理都非常相似，運用傳統(tǒng)方法很難準確區(qū)分道 地性白芍和非道地性白芍。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 基于此，有必要針對上述問題，提供一種白芍品種檢測方法，該方法以白芍基因的 多態(tài)性為基礎(chǔ)，在DNA分子標記技術(shù)水平進行檢測，對白芍的品種進行鑒別，從基因水平區(qū) 分道地性白芍和非道地性白芍。
[0008] 一種白芍品種檢測方法，包括以下步驟：
[0009] 建立鑒別模型：取不同品種的白芍，分別提取其DNA，然后將所提取到的DNA用引 物進行聚合酶鏈式反應(yīng)擴增，得到擴增產(chǎn)物，并對該擴增產(chǎn)物進行電泳分離，得到不同品種 白芍的DNA電泳圖，以該電泳圖的譜圖信息建立白芍品種鑒別模型；
[0010] 品種鑒別：取待測白芍，按照上述方法得到其DNA電泳圖，將該待測白芍電泳圖的 譜圖信息代入上述鑒別模型中進行分析，判定得到該白芍的品種；
[0011] 所述引物包括以下引物中的至少一種：
[0026] 本發(fā)明以DNA水平的分子標記為基礎(chǔ)，建立了上述白芍品種檢測方法，相對于傳 統(tǒng)形態(tài)鑒定具有巨大優(yōu)勢，在白芍藥材的研究和應(yīng)用中，為解決品種混亂和品種優(yōu)劣問題 提供了一種新的手段，也為白芍的引種和培育工作提供了技術(shù)支持。且該方法具有快速簡 便，只需要少量樣本即可實現(xiàn)的特點，可以鑒別白芍種苗的品種，從而可從基因水平選擇種 植品種，從源頭上保證藥材的質(zhì)量。
[0027] 并且，本發(fā)明通過篩選，得到上述ISSR引物，以該引物進行PCR擴增，得到的產(chǎn)物 能反映白芍品種的差異和類別，以該方法對白芍品種進行檢測，具有分類準確，方法穩(wěn)定且 重復(fù)性好的優(yōu)點。
[0028] 在其中一個實施例中，所述引物由引物1-引物13組成。選用上述所有引物作為 一個組合整體，所得到的PCR擴增產(chǎn)物具有電泳譜圖信息豐富多樣且穩(wěn)定的特點，最能體 現(xiàn)白芍品種的差異和類別。
[0029] 在其中一個實施例中，所述聚合酶鏈式反應(yīng)擴增的反應(yīng)體系為：DNA模板的濃度 為30~80ng/25 μ L，DNA聚合酶的濃度為I. 0~2. 0U/25 μ L，鎂離子的濃度為1. 5~2. 5m mol/L，dNTPs的濃度為180~270 μ mol/L，每種引物的濃度均為0. 2~0. 5 μ mol/L。上述 反應(yīng)體系具有較好的擴增效果，能夠得到穩(wěn)定且高質(zhì)高量的擴增產(chǎn)物，利于后續(xù)的分離及 鑒別。
[0030] 在其中一個實施例中，所述聚合酶鏈式反應(yīng)擴增的反應(yīng)程序為：首先93~98°C變 性3-5分鐘，93~98°C變性40-50秒，51~58°C退火40-50秒，然后70~75°C延伸80-100 秒，30-40個循環(huán)；最后70~75°C延伸8-12分鐘。上述反應(yīng)程序具有較好的擴增效果，能 夠得到穩(wěn)定且高質(zhì)高量的擴增產(chǎn)物，利于后續(xù)的分離及鑒別。
[0031] 在其中一個實施例中，所述譜圖信息通過以下方法得到：對電泳圖上重復(fù)性好且 條帶清晰的電泳條帶計數(shù)，有條帶記為1，無條帶記為〇,得到〇、1矩陣數(shù)據(jù)，該矩陣數(shù)據(jù)即 為譜圖信息。
[0032] 在其中一個實施例中，根據(jù)所述譜圖信息，算出各品種的白芍之間的相似系數(shù)，并 進行聚類分析，得到不同品種白芍的鑒別模型。
[0033] 在其中一個實施例中，提取白芍DNA的方法如下：將白芍置于預(yù)冷的研缽中，加 入液氮研磨成細粉，迅速轉(zhuǎn)移至離心管中；加入60-70°C預(yù)熱的十六烷基三甲基溴化銨 緩沖液，60-70°C水浴20-60分鐘；冷卻至室溫，加入體積比為20-28:1的氯仿：異戊醇混 合溶液混勻，10000-14000rpm離心10-20分鐘，取上清液，加入NaAc和無水乙醇，混勻后 10000_14000rpm離心3_7min，棄上清，得到DNA沉淀；再加入60-80%的乙醇溶液洗滌DNA 沉淀，并將該DNA沉淀于室溫晾干，即得。
[0034] 在其中一個實施例中，所述電泳分離的條件為：用瓊脂糖凝膠電泳法進行電泳，電 泳電壓為120~180V，電泳時間為0. 5h~lh。
[0035] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：
[0036] 本發(fā)明的白芍品種檢測方法，首先根據(jù)已知品種的白芍DNA建立品種鑒別模型， 再將待測白芍的DNA信息帶入該鑒別模型中，以DNA水平的分子標記為基礎(chǔ)進行白芍品種 的檢測，為道地性白芍和非道地性白芍的區(qū)分提供了有效可靠的鑒定手段。相對于傳統(tǒng)形 態(tài)鑒定具有巨大優(yōu)勢，在白芍藥材的研究和應(yīng)用中，為解決品種混亂和品種優(yōu)劣問題提供 了一種新的手段，也為