白芍的引種和培育工作提供了技術(shù)支持。且該方法具有快速簡(jiǎn)便，只 需要少量樣本即可實(shí)現(xiàn)的特點(diǎn)，可以鑒別白芍種苗的品種，從而可從基因水平選擇種植品 種，從源頭上保證藥材的質(zhì)量。
[0037] 并且，本發(fā)明還通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)篩選出最具代表性的引物，以及適宜的實(shí)驗(yàn)條件，提 高了該檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性和重復(fù)性。
【附圖說(shuō)明】
[0038] 圖1為實(shí)施例1中對(duì)照品白芍的聚類(lèi)樹(shù)形圖；
[0039] 圖2為實(shí)施例1中對(duì)照品和待測(cè)品白芍的聚類(lèi)樹(shù)形圖。
【具體實(shí)施方式】
[0040] 以下結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明解釋?zhuān)⒉粚?duì)本發(fā)明造成任何 限制。
[0041] 以下實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)儀器和試劑如下：
[0042] 儀器：核酸蛋白測(cè)定儀（Implen Nanophotometer)、PCR擴(kuò)增儀（BIO-RAD)、高速離 心機(jī)（Eppendorf 5418)、超低溫冰箱（Thermo 902-ULTS)、電泳儀、電泳槽（BIO-RAD)、凝膠 成像系統(tǒng)（Bio-Rad)。
[0043] 試劑：Taq DNA 聚合酶（Promega，5U/ μ L)、dNTP (Promega，IOmM)、DNAmarker (廣 州東盛生物科技有限公司）、10XLoading Buffer(Takara)、瓊脂糖（Biowest)、Golden View (北京博凌科為生物科技有限公司）。
[0044] 實(shí)施例1
[0045] 一種白芍品種檢測(cè)方法，包括以下步驟：
[0046] 一、建立鑒別模型。
[0047] 1、取不同品種的白芍對(duì)照品，采挖的對(duì)照品種類(lèi)為4年生有性繁殖白芍和4年生 無(wú)性繁殖白芍。
[0048] 有性繁殖白芍為滬譙公司十八里種植基地所栽樣品，是從山東引進(jìn)的品種，一共5 棵，分別標(biāo)記為基地1號(hào)、基地2號(hào)、基地3號(hào)、基地4號(hào)、基地5號(hào)。
[0049] 無(wú)性繁殖白芍為十八里散戶(hù)種植地的樣品，芽頭繁殖的亳州本地品種白芍，一共5 棵，分別標(biāo)記為1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)、4號(hào)、5號(hào)。
[0050] 2、提取上述已知品種的白芍基因組DNA。
[0051] 分別稱(chēng)取0. 2g白芍種苗嫩葉置于預(yù)冷的研缽中，加入液氮研磨成細(xì)粉，迅速轉(zhuǎn)移 至2mL離心管中；加入65°C預(yù)熱的CTAB(十六烷基三甲基溴化銨）緩沖液800 yL，65°C水浴 30分鐘；冷卻至室溫，加入800 μ L的氯仿：異戊醇（24:1)混合溶液并充分混勻，12000rpm 離心15分鐘；取上清液至一 I. 5mL離心管中，加入50 μ L NaAc，ImL無(wú)水乙醇，充分混勾， 12000rpm離心5min，棄上清；加入ImL體積百分濃度為70%的乙醇溶液洗滌DNA沉淀，并 將DNA沉淀于室溫晾干，晾干后加入100 μ L TE充分溶解，于-20°C保存?zhèn)溆茫? %瓊脂糖 凝膠電泳和紫外分光光度法檢測(cè)基因組DNA的質(zhì)量和濃度。
[0052] 3、分別將上述所提取的基因組DNA用以下引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。
[0053] 引物序列表
[0066] 引物 13 :CACACACACACACACARC
[0067] 注：R代表A或T，Y代表C或G
[0068] 其中：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體積為25 μ L。反應(yīng)體系成分為：2. 5 μ L IOXbuffer緩沖 液（即DNA凝膠加樣緩沖液），2. 0 μ L濃度為25mmol/L的MgCl2,0· 5 μ L濃度為lOmmol/L 的dNTPs，0. 75 μ L濃度為10 μ mol/L的引物，上述得到的DNA模板50ng，0. 3 μ L濃度為5U/ μ L的DNA聚合酶，剩余體積用超純水補(bǔ)足25 μ L。
[0069] 反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為：95°C，5分鐘；隨后95°C，45秒；51~58°C退火，45秒；72°C，90 秒，35個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸，10分鐘。
[0070] 4、用瓊脂糖凝膠電泳分別對(duì)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離
[0071 ] 用I X TAE緩沖液配置1 %瓊脂糖200mL，搖勻溶化，用微波爐煮沸至澄清透明。在 熱膠中加入Golden View 8. 3 yL搖勾，待自然冷卻至50°C左右，灌膠于插好樣品梳的電泳 槽中制板。凝膠完全凝固后，小心取出梳子。將凝膠放入電泳槽內(nèi)，加樣孔一側(cè)靠負(fù)極，加入 適量的TAE工作緩沖液，使其液面恰好沒(méi)過(guò)膠面約Imm深。用移液器將10 X loading buffer 混合的樣品DNA和分子量標(biāo)準(zhǔn)（Marker)從點(diǎn)樣孔分別垂直加入點(diǎn)樣孔中。加樣完畢后，正 確連接電泳槽和電源，電泳電壓180V，電泳0. 5h后至指示劑溴酚藍(lán)距底端約2cm時(shí)取出凝 膠板，在凝膠分析系統(tǒng)上進(jìn)行分析，照相存盤(pán)。
[0072] 5、建立白芍品種鑒別模型。
[0073] 對(duì)重復(fù)性好且條帶清晰的電泳條帶計(jì)數(shù)，每條DNA譜帶作為一個(gè)單位，有條帶記 為1，無(wú)條帶記為〇,得到〇、1矩陣數(shù)據(jù)，以1、〇矩陣輸入NTSys軟件，算出各樣品之間的相 似系數(shù)，如下表1所示，并采用UPGM算法進(jìn)行各品種間聚類(lèi)分析，如圖1所示，構(gòu)建聚類(lèi)樹(shù) 形圖，得到白芍品種鑒別模型。
[0074] 表1已知品種白芍之間的相似系數(shù)
[0076] 二、品種鑒別
[0077] 1、取下述表2待測(cè)樣品。
[0078] 表2白芍采樣情況表
[0079]
[0080] 2、按照上述方法，提取得到其DNA電泳圖，按照上述電泳條帶計(jì)數(shù)方法，得到0、I 矩陣數(shù)據(jù)，算出各樣品之間的相似系數(shù)，如下表3所示，并采用UPGM算法進(jìn)行各品種間聚 類(lèi)分析，如圖2所示，構(gòu)建聚類(lèi)樹(shù)形圖，待測(cè)種苗樣品在聚類(lèi)分析圖中與哪種對(duì)照品聚為一 大類(lèi)，即可認(rèn)為待測(cè)樣品與該種對(duì)照品為同一品種的白芍。
[0081] 表3各樣品白芍之間的相似系數(shù)
[0084] 三、檢測(cè)結(jié)果。
[0085] 由聚類(lèi)分析圖1可知，引進(jìn)品種白芍對(duì)照品基地1號(hào)-基地5號(hào)聚為一大類(lèi)，亳州 本地品種白芍對(duì)照品1號(hào)-5號(hào)聚為一大類(lèi)，與采樣情況一致。
[0086] 由聚類(lèi)分析圖2可知，樣品SN8、SN9、SNlO (即十河采集的三個(gè)樣本）與對(duì)照品基 地1號(hào)、基地2號(hào)和基地3號(hào)聚為一大類(lèi)，為引進(jìn)品種白芍；樣品SN1、SN2、SN3、SN4、SN5、 SN6和SN7(即十八里采集的三個(gè)樣本、十九里采集的三個(gè)和十河采集的一個(gè)樣本）與對(duì)照 品1號(hào)、3號(hào)、4號(hào)聚為一大類(lèi)，為亳州白芍本地品種。
[0087] 從上述結(jié)果來(lái)看，采用本發(fā)明的方法可以簡(jiǎn)單快捷的鑒定白芍種苗的品種，解決 白芍種苗從外觀難以鑒別品種的難題，為白芍的大規(guī)模種植提供重要的品種選育技術(shù)支 持。
[0088] 實(shí)施例2
[0089] 一種白芍品種檢測(cè)方法，與實(shí)施例1的方法基本相似，不同之處在于：
[0090] 為了得到擴(kuò)增產(chǎn)物，所采用的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系成分為：
[0091] 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體積為25 μ L。反應(yīng)體系成分為：2. 5 μ L IOXbuffer緩沖液（即 DNA凝膠加樣緩沖液），I. 0 μ L濃度為25mmol/L的MgCl2,0. 3 μ L濃度為lOmmol/L的dNTPs， 〇· 5 μ L濃度為10 μ mol/L的弓丨物，上述得至Ij的DNA模板20ng，0· 1 μ L濃度為5U/ μ L的DNA 聚合酶，剩余體積用超純水補(bǔ)足。
[0092] 將上述得到的擴(kuò)增產(chǎn)物用用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行電泳分離，與實(shí)施例1相比，電 泳條帶少，且模糊，難以進(jìn)行后續(xù)的聚類(lèi)分析和相似系數(shù)的計(jì)算。
[0093] 實(shí)施例3
[0094] -種白芍品種檢測(cè)方法，與實(shí)施例1的方法基本相似，不同之處在于：
[0095] 為了得到擴(kuò)增產(chǎn)物，所采用的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系成分為：
[0096] 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體積為25 μ L。反應(yīng)體系成