牡丹內(nèi)生真菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物內(nèi)生真菌技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種產(chǎn)丹皮酚的牡丹內(nèi)生真菌及其 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物內(nèi)生真菌是指整個(gè)生活史或者生活史中的某一個(gè)階段存在于植物組織內(nèi)部 或者組織間隙，且不會(huì)引起宿主出現(xiàn)明顯病癥或者沒有對(duì)宿主造成明顯傷害的一類真菌。 國內(nèi)外越來越多的研究表明，植物在與內(nèi)生真菌相互作用的過程中，內(nèi)生真菌能產(chǎn)生與植 物相同或相似的活性物質(zhì)。內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物的種類繁多，包括生物堿類、醌類、酸、甾 體類、萜類、肽類等，藥理活性廣泛，主要表現(xiàn)為抗腫瘤、抗菌、抗病毒、殺蟲、抗結(jié)核等。目 前，從藥用植物中分離培養(yǎng)能產(chǎn)生活性物質(zhì)的內(nèi)生真菌已成為學(xué)者的研究趨勢。
[0003] 牡丹是我國特有的木本名貴花卉，在我國山東菏澤、安徽銅陵、重慶墊江、河南洛 陽等地均有大規(guī)模商品化種植。丹皮又稱為牡丹皮，為牡丹的干燥根皮，其性微寒，味苦、 辛，歸心、肝、腎經(jīng)，具有清熱涼血、活血化瘀的功效，為我國傳統(tǒng)中藥材。丹皮酚是牡丹丹皮 中主要的有效藥用活性成分，鳳丹皮作為丹皮中的道地藥材，其丹皮酚含量最高。丹皮酚具 有解熱、鎮(zhèn)痛、抗真菌、抗病毒、抗癌等作用。從牡丹中分離出能產(chǎn)生丹皮酚的內(nèi)生真菌，將 為丹皮酚的生產(chǎn)提供有益幫助。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種產(chǎn)丹皮酚的牡丹內(nèi)生真菌。
[0005] 同時(shí)，本發(fā)明還提供一種上述牡丹內(nèi)生真菌在生產(chǎn)丹皮酚或制備生防菌劑中的應(yīng) 用。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：
[0007] 牡丹內(nèi)生真菌，為鐮刀菌屬（Fusariumsp.)A7J2_01，保藏編號(hào)：CCTCCN0:M 2014663,保藏日期：2014年12月24日，保藏單位：中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC)，保藏 地址：中國.武漢.武漢大學(xué)（湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)保藏中心）。
[0008] 牡丹內(nèi)生真菌（CCTCCN0:M2014663)為鐮刀菌屬，鐮刀菌屬無性時(shí)期原屬于半知 菌類，叢梗孢目，瘤座孢科。在PDA培養(yǎng)基上生長5d后，菌落呈現(xiàn)白色，呈平鋪狀生長，菌落 直徑達(dá)到7cm，幾乎覆蓋整個(gè)平板，菌絲生長高度達(dá)到0. 3cm，培養(yǎng)基背面呈現(xiàn)較深的灰色， 菌落質(zhì)地較為疏松，繼續(xù)培養(yǎng)到30d，菌落顏色慢慢轉(zhuǎn)為棕褐色，培養(yǎng)基背面呈現(xiàn)的灰色繼 續(xù)加深，最終變?yōu)楹谏?。觀察顯微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)分生孢子梗短粗，分生孢子無色，大型分生孢子 兩端尖，彎曲狀，呈鐮刀形。其生長溫度為25°C，生長pH值自然。
[0009] 牡丹內(nèi)生真菌（CCTCCNO:M2014663)在生產(chǎn)丹皮酚中的應(yīng)用。
[0010] 牡丹內(nèi)生真菌（CCTCCN0:M2014663)在制備生防菌劑中的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明的有益效果：
[0012] 本發(fā)明從牡丹植株中分離出一株能夠產(chǎn)丹皮酚的內(nèi)生真菌A7J2-01，其在PDA培 養(yǎng)基上生長5d后，菌落呈現(xiàn)白色，呈平鋪狀生長，菌落直徑達(dá)到7cm，幾乎覆蓋整個(gè)平板，菌 絲生長高度達(dá)到〇. 3cm，培養(yǎng)基背面呈現(xiàn)較深的灰色，菌落質(zhì)地較為疏松，繼續(xù)培養(yǎng)到30d， 菌落顏色慢慢轉(zhuǎn)為棕褐色，培養(yǎng)基背面呈現(xiàn)的灰色繼續(xù)加深，最終變?yōu)楹谏Ｓ^察顯微結(jié) 構(gòu)，發(fā)現(xiàn)分生孢子梗短粗，分生孢子無色，大型分生孢子兩端尖，彎曲狀，呈鐮刀形。ITS序列 分析表明，內(nèi)生真菌A7J2-01基因組擴(kuò)增序列與序列號(hào)KF624786. 1的序列相似性高達(dá)99% 以上，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果，鑒定該內(nèi)生真菌為鐮刀菌屬（Fusariumsp.)，保藏于中國典型 培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)：CCTCCNO:M2014663。
[0013] 本發(fā)明中牡丹內(nèi)生真菌（CCTCCN0:M2014663)能夠合成丹皮中主要的有效成分 丹皮酚，通過大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)鐮刀菌屬A7J2-01，即可在短時(shí)間內(nèi)獲得大量菌絲，從而獲得 丹皮酚，該方法可替代采挖植物藥材獲得丹皮酚，為生產(chǎn)丹皮酚提供新的思路。
[0014] 保藏證明和存活證明說明
[0015] 保藏菌株：牡丹內(nèi)生真菌，為鐮刀菌屬（Fusariumsp. )A7J2-01，保藏編號(hào)： CCTCCN0:M2014663,保藏日期：2014年12月24日，保藏單位：中國典型培養(yǎng)物保藏中心 (CCTCC)，保藏地址：中國.武漢.武漢大學(xué)（湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)保藏中 心）。
【附圖說明】
[0016] 圖1為實(shí)施例1中供試品A7J2-01提取液的GC色譜圖；
[0017] 圖2為對(duì)照品丹皮酚的GC色譜圖；
[0018] 圖3為內(nèi)生真菌A7J2-01的菌落形態(tài)圖；
[0019] 圖4為內(nèi)生真菌A7J2-01的孢子囊形態(tài)圖；
[0020] 圖5為內(nèi)生真菌A7J2-01基因組PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖；
[0021] 圖6為內(nèi)生真菌A7J2-01的系統(tǒng)進(jìn)化樹；
[0022] 圖7為丹皮酚對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 下述實(shí)施例僅對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的任何限制。
[0024] 實(shí)施例1
[0025] -、牡丹內(nèi)生真菌的分離培養(yǎng)
[0026] 牡丹內(nèi)生真菌（CCTCCN0:M2014663)分離自健康的人工種植的安徽鳳丹的根、 莖、葉，鳳丹采自中國安徽銅陵鳳凰山，植株年齡五年，植株健壯，無病蟲害（詳見"遺傳資 源來源披露登記表"）。
[0027] 具體的分離培養(yǎng)步驟如下：
[0028] 1)將五年生牡丹植株的根和莖切成1. 5cm左右的小段，葉切成2cm2左右的小片， 在超凈工作臺(tái)內(nèi)對(duì)其表面消毒：根和莖分別用75%的酒精浸泡lmin，無菌水沖洗干凈，再 浸泡于5 %次氯酸鈉溶液4min，無菌水沖洗干凈，在無菌水中漂洗；葉用75 %的酒精浸泡 20s，無菌水沖洗干凈，在無菌水中漂洗，再浸泡于5%次氯酸鈉溶液45s，無菌水沖洗干凈， 在無菌水中漂洗；
[0029] 2)將消毒過的根和莖用無菌手術(shù)刀縱向剖開，葉剪成梳狀，將根和莖的縱剖面平 鋪在加有慶大霉素（4萬U/L)的PDA培養(yǎng)基平皿上，葉平鋪在平皿中，各重復(fù)5次，同時(shí)取 消毒過程中的前中后三個(gè)階段的漂洗液滴在培養(yǎng)皿中做對(duì)照來驗(yàn)證表面消毒的狀況；
[0030] 3)將上述培養(yǎng)皿放入25°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天定時(shí)觀察記錄內(nèi)生真菌的生 長狀況，在培養(yǎng)基上觀察到有菌絲生成時(shí)，及時(shí)采用尖端菌絲挑取法，挑取形態(tài)不同的菌絲 或菌落移種到新鮮PDA培養(yǎng)基上，繼續(xù)培養(yǎng)，待長出菌絲后繼續(xù)分離純化，直到分離到單一 菌株；
[0031] 4)將單一菌株接種在PDA試管斜面培養(yǎng)基中，4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0032] PDA培養(yǎng)基制備方法如下：取新鮮馬鈴薯200g，切塊，用蒸餾水煮沸30min，四層紗 布過濾取濾液，之后加入葡萄糖20g，瓊脂17g充分溶解后再用蒸餾水補(bǔ)足到1000mL。將配 成的培養(yǎng)基在121°C下滅菌30min后，在超凈工作臺(tái)內(nèi)分裝至無菌培養(yǎng)皿中備用。
[0033] 斜面PDA培養(yǎng)基為：取5mLPDA培養(yǎng)基裝于試管中，121°C高壓滅菌30min，鋪成斜 面冷卻，以備保存菌種。
[0034] 結(jié)果：從五年生安徽鳳丹的根、莖、葉中分離出內(nèi)生真菌21株，并且對(duì)照組培養(yǎng)基 上并未長菌，證明所消毒程序徹底，分離到的菌是植物內(nèi)生真菌，而不是表面的附生菌。
[0035] 二、牡丹內(nèi)生真菌產(chǎn)丹皮酚能力的測定
[0036] 將分離到的單一菌株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)：分離到的每株內(nèi)生真菌接種20個(gè)90mm的 PDA培養(yǎng)皿，倒置在25°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)25天，待菌絲成熟后，用無菌手術(shù)刀片刮取菌 絲，將刮取的菌絲用無水甲醇進(jìn)行研磨，研磨碎之后按照lg/20mL料液比用甲醇定容，在室 溫下進(jìn)行超聲浸提30分鐘，取浸提液加入2mL離心管中，以8000r/min的轉(zhuǎn)速離心10分鐘， 之后取上清液，用〇. 22ym的微孔濾膜進(jìn)行過濾，取其濾液做成內(nèi)生真菌提取物。同時(shí)，將 市售的丹皮酚標(biāo)準(zhǔn)品晶體用甲醇溶解，做成標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
[0037] 取內(nèi)生真菌提取物進(jìn)行GC檢測，丹皮酚的標(biāo)準(zhǔn)品同時(shí)也進(jìn)行GC檢測，GC檢測條 件：色譜柱為AgilentHP-5MS石英毛細(xì)管柱（30mX0.25mmX0.25ym);載氣為高純氦氣， 流速為lmL.minS