進(jìn)樣口溫度250°C，氣化溫度280°C。電子能量70eV，離子源溫度230°C， 四級(jí)桿溫度150°C，掃描范圍20~350aum。
[0038] 將內(nèi)生真菌提取物的GC檢測(cè)結(jié)果和標(biāo)準(zhǔn)品GC檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，若提取物檢測(cè) 結(jié)果的出峰時(shí)間和標(biāo)準(zhǔn)品一致，則能判定內(nèi)生真菌提取物中含有和標(biāo)準(zhǔn)品一致的化學(xué)物 質(zhì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中一株A7J2-01菌的檢測(cè)結(jié)果在6. 86分鐘（見(jiàn)圖1)有一處明顯峰和丹皮 酸標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間：6. 87分鐘（見(jiàn)圖2) -致，表明A7J2-01菌株產(chǎn)生了丹皮酸。注：圖1、 圖2中字母A均表示丹皮酚。
[0039] 三、菌落形態(tài)及孢子形態(tài)鑒定
[0040] 取篩選的內(nèi)生真菌A7J2-01，根據(jù)《真菌鑒定手冊(cè)》進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，其菌株的菌落 特征和孢子形態(tài)與鐮刀菌屬極為相近，菌落形態(tài)以及孢子形態(tài)如圖3、圖4所示。圖3中A 為培養(yǎng)基正面，B為背面。
[0041] 內(nèi)生真菌A7J2-01在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)5d后，菌落呈現(xiàn)白色，呈平鋪狀生長(zhǎng)，菌落 直徑達(dá)到7cm，幾乎覆蓋整個(gè)平板，菌絲生長(zhǎng)高度達(dá)到0. 3cm，培養(yǎng)基背面呈現(xiàn)較深的灰色， 菌落質(zhì)地較為疏松，繼續(xù)培養(yǎng)到30d，菌落顏色慢慢轉(zhuǎn)為棕褐色，培養(yǎng)基背面呈現(xiàn)的灰色繼 續(xù)加深，最終變?yōu)楹谏?。?0天左右顯微觀察菌絲，發(fā)現(xiàn)分生孢子梗短粗，分生孢子無(wú)色， 大型分生孢子兩端尖，彎曲狀，呈鐮刀形。其生長(zhǎng)溫度為25°C，生長(zhǎng)pH值自然。
[0042] 四、分子鑒定
[0043] 取適量真菌組織在研缽中加入液氮充分研磨成細(xì)粉，然后采用DN41真菌基因 組DNA快速提取試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司）提取基因組DNA，利用通用引物 ITS1 (如SEQIDNO. 1所示）和ITS4 (如SEQIDN0. 2所示），對(duì)目的片段進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn) 物瓊脂糖電泳后經(jīng)DNA膠純化試劑盒（AXYGEN公司）回收純化，成像結(jié)果如圖5所示，圖中 左邊泳道表示Marker，右邊泳道表示擴(kuò)增產(chǎn)物。在550bp附近得到一擴(kuò)增片段，證明已成功 從A7J2-01菌株中提取其基因組DNA。純化產(chǎn)物交上海生工生物工程公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果的 喊基序列如SEQIDN0. 3所不。
[0044] 測(cè)得的ITS序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中應(yīng)用BLAST分析進(jìn)行同源性比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該序 列與序列編號(hào)KF624786. 1 的序列（Fusariumsp. 2RIFA174A18SribosomalRNAgene) 相似性高達(dá)99%，與其他相似性較高的幾個(gè)序列建立進(jìn)化樹(shù)（見(jiàn)圖6)，并結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察， 確定內(nèi)生真菌A7J2-01為鐮刀菌屬（Fusarium)。
[0045] 將牡丹內(nèi)生真菌A7J2-01交由中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC)保藏，名稱為鐮 刀菌屬（Fusariumsp.)A7J2-01，保藏編號(hào)：CCTCCN0:M2014663,保藏日期：2014 年 12 月 24日，保藏地址：中國(guó).武漢.武漢大學(xué)（湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)保藏中心）。
[0046] 試驗(yàn)例
[0047] 牡丹內(nèi)生真菌（CCTCCN0:M2014663)A7J2-01菌絲中丹皮酚含量的測(cè)定：
[0048] -、馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)法培養(yǎng)A7J2-01
[0049] 馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基配制方法：取新鮮馬鈴薯200g，切塊，用蒸餾水水煮沸 30min，四層紗布過(guò)濾取濾液，之后加入葡萄糖20g，充分溶解后再用蒸餾水補(bǔ)足到1000mL。 將配成的液體培養(yǎng)基在121°C下滅菌30min后，在超凈工作臺(tái)內(nèi)分裝至無(wú)菌的150mL的三角 瓶?jī)?nèi)，每個(gè)三角瓶?jī)?nèi)裝100mL。
[0050] 從PDA平板上取直徑為0? 5cm的A7J2-01 (25°C恒溫培養(yǎng)7天）菌餅分別接種到盛 有100mL液體培養(yǎng)基的4個(gè)150mL三角瓶中（8個(gè)/瓶），放入25°C氣浴搖床中，以150r/ min的轉(zhuǎn)速，震蕩培養(yǎng)7天。培養(yǎng)7天后，用真空抽濾的方法得到新鮮菌絲，稱取其重量；新 鮮菌絲按照l(shuí)g/l〇mL的比例用甲醇進(jìn)行研磨，研磨后裝入具塞三角瓶?jī)?nèi)在室溫下進(jìn)行超聲 浸提30min，浸提后靜置，取上清液置于10mL離心管中，以12000r/min的轉(zhuǎn)速離心5min，再 次取上清液，放入10mL的離心管中得菌絲提取液，以供用紫外分光光度法檢測(cè)菌絲中丹皮 酸含量。
[0051] 二、紫外分光光度法檢測(cè)菌絲中丹皮酚含量
[0052] 精密稱取丹皮酚對(duì)照品4mg，置50mL的量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成濃 度為80yg/mL的對(duì)照品溶液，然后稀釋成不同濃度梯度的丹皮酚標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為 0? 8yg/mL、1. 6yg/mL、3. 2yg/mL、4. 8yg/mL、6. 4yg/mL、8yg/mL，每種濃度進(jìn)樣 3mL。用 紫外分光光度計(jì)檢測(cè)對(duì)照品相應(yīng)濃度的吸光值，以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制丹 皮酚對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線。不同濃度丹皮酚的吸光度見(jiàn)下表1，標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖7,線性方程：y =0. 0803x+0. 004,R2= 0. 9992,說(shuō)明在0. 8~8yg/mL的濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。根 據(jù)線性方程將菌絲提取液的試驗(yàn)樣品進(jìn)行丹皮酚含量測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)下表2 (數(shù)據(jù)以平 均值的形式表示）。其中，菌絲中丹皮酚含量計(jì)算如下：
[0053] 丹皮酚含量（yg/g)=測(cè)得的丹皮酚含量（yg/mL)X菌絲提取液體積（mL) /菌 絲鮮重（g)。
[0054] 表1丹皮酚對(duì)照品濃度（x)和吸光度（y)
[0055]
[0056] 表2菌絲鮮重和菌絲中丹皮酚含量值
[0057]
[0058] 由表2可知，生長(zhǎng)7天的A7J2-01菌絲中含量平均值可以達(dá)到344yg/g。
[0059] 丹皮酚是牡丹丹皮中主要的有效藥用活性成分，鳳丹皮作為丹皮中的道地藥材， 其丹皮酚含量最高。本發(fā)明從牡丹植株中分離出一株能夠產(chǎn)丹皮酚的內(nèi)生真菌A7J2-01， 通過(guò)7天的液體發(fā)酵培養(yǎng)，菌絲中丹皮酚含量可以達(dá)到344yg/g。由此可以推測(cè)，產(chǎn)丹皮 酚的內(nèi)生真菌A7J2-01對(duì)生產(chǎn)丹皮酚起到一定的積累或者調(diào)控作用，使鳳丹更容易抗病蟲(chóng) 害，從而成就其道地性品質(zhì)。通過(guò)大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)鐮刀菌屬A7J2-01，即可在短時(shí)間內(nèi)獲得 大量菌絲，從而獲得丹皮酚。該方法可替代采挖植物藥材獲得丹皮酚，從而有效保護(hù)中藥材 和自然環(huán)境。
[0060] 實(shí)施例2
[0061] 牡丹內(nèi)生真菌在生產(chǎn)丹皮酚中的應(yīng)用，具體為：取牡丹內(nèi)生真菌（CCTCCN0:M 2014663)發(fā)酵培養(yǎng)，抽濾得新鮮菌絲，加入甲醇研磨后室溫下超聲浸提，靜置，取上清液，回 收甲醇，即得。
[0062] 實(shí)施例3
[0063] 牡丹內(nèi)生真菌在制備生防菌劑中的應(yīng)用，具體為：取牡丹內(nèi)生真菌（CCTCCN0:M 2014663)發(fā)酵培養(yǎng)，抽濾得新鮮菌絲，即得。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 牡丹內(nèi)生真菌，其特征在于：其為鐮刀菌屬（Fusarium sp. )A7J2-01，保藏編號(hào)： CCTCC NO:M 2014663〇2. 如權(quán)利要求1所述的牡丹內(nèi)生真菌在生產(chǎn)丹皮酚中的應(yīng)用。3. 如權(quán)利要求1所述的牡丹內(nèi)生真菌在制備生防菌劑中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種牡丹內(nèi)生真菌及其應(yīng)用，屬于植物內(nèi)生真菌技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明從牡丹植株中分離出一株能夠產(chǎn)丹皮酚的內(nèi)生真菌A7J2-01，為鐮刀菌屬(Fusarium？sp.)，保藏編號(hào)：CCTCC？NO:M？2014663，保藏日期：2014年12月24日，保藏單位：中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址：中國(guó).武漢.武漢大學(xué)。該菌株能夠合成丹皮中主要的有效成分丹皮酚，通過(guò)大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)即可在短時(shí)間內(nèi)獲得大量菌絲，從而獲得丹皮酚，該方法可替代采挖植物藥材獲得丹皮酚，為生產(chǎn)丹皮酚提供新的思路。CCTCC NO: M 201466320141224
【IPC分類】A01P3/00, A01N63/04, C12N1/14, A01P1/00, C12R1/77, C12P7/26
【公開(kāi)號(hào)】CN105039176
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510411914
【發(fā)明人】楊國(guó)棟, 孟利芬, 李鵬, 董發(fā)明, 邱妍, 林霖
【申請(qǐng)人】河南科技大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年11月11日
【申請(qǐng)日】2015年7月14日