一種提高花青素含量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，尤其涉及一種利用柑橘八氫番茄紅素合成酶基因 (CitPSY)來提高草莓花青素含量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 草莓（Fragaria anannassa Duch.)屬薔薇科草莓屬多年生草本植物。草莓全基 因組比較小，二倍體的基因組大小約240Mbp。對(duì)生長環(huán)境要求不高，在各地均可種植。與其 它果樹相比，草莓的生長期比較短，在短時(shí)間內(nèi)可以得到果實(shí)?；蚬こ處煵葺N的新途 徑之一，其再生及遺傳轉(zhuǎn)化體系等已較成熟。加之草莓為無性繁殖，目的基因轉(zhuǎn)入植株中表 達(dá)后，可以通過組織培養(yǎng)、分株繁殖等無性繁殖方式進(jìn)行保存和擴(kuò)繁。因此，草莓是柑橘等 童期長的果樹中相關(guān)基因功能驗(yàn)證的良好植物材料之一。
[0003] 草莓中主要含有的色素為花青素?；ㄇ嗨厥且环N水溶性色素，其基本骨架是2-苯 基苯并吡喃陽離子（2-phenylbenzo-pyryalium),如式1所示（張寧，2008)。在自然界中 游離的花青素不穩(wěn)定，常與一個(gè)或多個(gè)葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖等形成糖苷貯藏 在液泡中，糖苷使花青素更加穩(wěn)定，但不會(huì)影響花青素的顏色，花青素的顏色是由R1和R2 位置上的不同取代基決定的（式1)。在植物中常見的花青素有六種：飛燕草色素（Dp)、矢 車菊色素（Cy)、天竺葵色素（Pg)、錦葵色素（Mv)、芍藥色素（Pn)和牽牛花色素（Pt)。
[0004]
[0005] 式1中，札=R2= H時(shí)，為天竺葵色素（Pelargonidin) ;R丨二H, R 2= 0H時(shí)，為矢 車菊色素（Cyanidin) ;1^=1?2=011 時(shí)，為飛燕草色素（Delphinidin) 時(shí)，為茍藥色素（?6〇111(1；[11);1?1=011，1? 2=0013時(shí)，為牽?；ㄉ兀?61：11111(1；[11);1?1=1? 2 = 0013時(shí)，為錦葵花色素（Malvidin)。
[0006] 花青素具有良好的保健功能，例如：增強(qiáng)視力，消除眼睛疲勞；延緩腦神經(jīng)衰老， 改善睡眠；對(duì)由糖尿病引起的毛細(xì)血管病有治療作用；增強(qiáng)心肺功能；預(yù)防老年癡呆，預(yù)防 癌癥；美容養(yǎng)顏，清除自由基。
[0007]八氫番茄紅素合成酶（PSY)是類胡蘿卜素代謝中的核心酶，也是最重要的限速 酶。根據(jù)已有的研究成果，八氫番茄紅素合成酶的作用是催化2分子的櫳牛兒基櫳牛兒基 焦磷酸（GGPP)，從而生成無色八氫番茄紅素。因?yàn)榘藲浞鸭t素合成酶對(duì)類胡蘿卜素重 要的限速作用，因此，目前主要是利用PSY基因通過基因工程技術(shù)來改變類胡蘿卜素的積 累。目前已從玉米、擬南芥、溫州蜜柑、辣椒等多種植物中分離出了 PSY基因（Palaisa K A， 2003)〇
[0008] 草莓中主要含有花青素，而只含有少量的類胡蘿卜素。柑橘中則積累大量的類胡 蘿卜素，這表明植物只優(yōu)先積累某一種色素，且植物積累哪一種色素是由植物進(jìn)化決定的。 花青素是水溶性色素，類胡蘿卜素是脂溶性色素，兩者在分子結(jié)構(gòu)上存在顯著區(qū)別，合成代 謝途徑也完全不同。Davison等（2002)研究發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中超量表達(dá)HYD基因，類胡蘿卜 素的含量增加，積累的花青素減少；曹洪波（2012)在研究蘋果愈傷組織時(shí)發(fā)現(xiàn)類胡蘿卜素 的大量積累會(huì)導(dǎo)致花青素的合成減少，調(diào)控花青素合成的基因表達(dá)量下調(diào)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 鑒于現(xiàn)有技術(shù)所存在的問題，本發(fā)明提供一種柑橘八氫番茄紅素合成酶基因 CitPSY的新用途，以及利用柑橘八氫番茄紅素合成酶基因CitPSY來提高草莓花青素含量 的方法，通過在草莓表達(dá)柑橘八氫番茄紅素合成酶基因可以顯著提高草莓果實(shí)中花青素的 含量。
[0010] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下：
[0011] 本發(fā)明提供了柑橘八氫番茄紅素合成酶基因CitPSY的新用途，即將柑橘八氫番 茄紅素合成酶基因CitPSY用于轉(zhuǎn)入草莓中以提高草莓花青素含量的用途。
[0012] 所述柑橘八氫番茄紅素合成酶基因CitPSY的詳細(xì)信息可以在NCBI網(wǎng)站的查詢， 編號(hào)為Gene ID:102578001。也可以參見參考文獻(xiàn)：張建成.紅肉臍橙類胡蘿卜素合成酶基 因（CsPSY、CsLCYb)功能分析與CrtB轉(zhuǎn)基因?qū)︻惡}卜素生物合成的影響.[博士學(xué)位論 文].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009。上述文獻(xiàn)中的紅肉臍橙類胡蘿卜素合成酶基因（CsPSY) 在本發(fā)明的描述中的名稱為柑橘八氫番茄紅素合成酶基因（CitPSY)。
[0013] -種提高草莓花青素含量的方法，包括以下步驟：
[0014] 1)構(gòu)建柑橘八氫番茄紅素合成酶基因CitPSY表達(dá)質(zhì)粒；
[0015] 2)利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將步驟1)構(gòu)建的柑橘八氫番茄紅素合成酶基因CitPSY表達(dá) 質(zhì)粒轉(zhuǎn)入草莓中，獲得轉(zhuǎn)柑橘八氫番茄紅素合成酶基因CitPSY的草莓；
[0016] 3)將轉(zhuǎn)柑橘八氫番茄紅素合成酶基因CitPSY的草莓進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定；
[0017] 4)檢測表達(dá)柑橘八氫番茄紅素合成酶基因CitPSY的草莓中花青素含量；
[0018] 5)轉(zhuǎn)柑橘八氫番茄紅素合成酶基因CitPSY草莓中花青素代謝相關(guān)基因表達(dá)量檢 測。
[0019] 本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明通過在草莓中表達(dá)CitPSY基因可以顯著提高草莓中 的花青素的含量。
[0020] 本發(fā)明所述的提高草莓花青素含量的方法是以質(zhì)粒的形式攜帶CitPSY并將其一 起轉(zhuǎn)入草莓中進(jìn)行表達(dá)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體并進(jìn)行相應(yīng)的優(yōu)化，實(shí) 施例中只是提供了效果較好的技術(shù)方案，但不只局限于實(shí)施例中的技術(shù)方案。另外，除了質(zhì) 粒的形式以外，也可以通過其他的方式，例如將CitPSY整合到草莓的染色體上從而提高草 莓中花青素的含量。
[0021 ] 在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本發(fā)明還可以做如下改進(jìn)。
[0022] 進(jìn)一步，步驟2)所述獲得轉(zhuǎn)柑橘八氫番茄紅素合成酶基因的草莓的方法包括以 下步驟：
[0023] 21)制備草莓無菌試管苗材料；
[0024] 22)制備接種用的草莓外植體；
[0025] 23)利用葉盤法農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化。
[0026] 進(jìn)一步，步驟23)所述利用葉盤法農(nóng)桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化具體包括以下步驟：
[0027] a)將含有CitPSY表達(dá)質(zhì)粒的農(nóng)桿菌劃線培養(yǎng)；
[0028] b)將草莓外植體于固體外植體再生培養(yǎng)基暗培養(yǎng)，得到葉盤；
[0029] c)取步驟a)的單菌落接種于含有抗生素的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)；
[0030] d)取步驟c)中培養(yǎng)的菌液接種到不含有抗生素的液體培養(yǎng)基中，擴(kuò)大培養(yǎng)；
[0031] e)取步驟d)培養(yǎng)的菌液離心，棄上清，重懸；
[0032] f)將步驟b)培養(yǎng)的葉盤無菌條件下懸浮備用；
[0033] g)將步驟f)懸浮用的液體濾出，向葉盤中加入步驟e)重懸的菌液，搖動(dòng)，濾出菌 液，將葉片多余菌液吸干后，接于固體的外植體再生培養(yǎng)基上進(jìn)行共培養(yǎng)，所述共培養(yǎng)為暗 培養(yǎng)，之后進(jìn)行推遲篩選，所述推遲篩選也為暗培養(yǎng)；
[0034] h)將推遲篩選后的葉片接于篩選培養(yǎng)基；
[0035] i)進(jìn)行暗培養(yǎng)至葉片長出愈傷組織后轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)，篩選抗性芽；
[0036] j)將篩選培養(yǎng)后得到的抗性芽切下，接在含有抗生素的植株繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)， 當(dāng)芽體長出并出現(xiàn)較多小葉片后，移至含有抗生素的生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根；
[0037] 上述步驟c)、j)中所述的抗生素的抗性與柑橘八氫番茄紅素合成酶基因表達(dá)質(zhì) 粒所攜帶的抗性基因抗性一致。
[0038] 進(jìn)一步，步驟g)中，所述外植體再生培養(yǎng)基為以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加終濃度為 1. 5mg/L的脫葉靈和終濃度為0. 2mg/L的吲哚丁酸。所述共培養(yǎng)時(shí)間為3d，推遲篩選的時(shí) 間為7-14d。
[0039] 進(jìn)一步，步驟h)中，所述篩選培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加終濃度為1. 5mg/L 的脫葉靈、終濃度為〇. 2mg/L的吲哚丁酸、終濃度為250mg/L的頭孢霉素和終濃度為10mg/ L的卡那霉素。
[0040] 進(jìn)一步，步驟j)中，所述含有抗生素的植株繼代培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加 終濃度為〇. 2mg/L的6-芐基腺嘌呤、終濃度為0. 02mg/L的吲哚丁酸、終濃度為0. 2mg/L的 赤霉素、終濃度為l〇mg/L的卡那霉素和終濃度為250mg/L的頭孢霉素。
[0041 ] 進(jìn)一步，步驟j)中，所述含有抗生素的生根培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基的稀釋兩倍后同時(shí) 添加終濃度為0. 2mg/L的吲哚丁酸、終濃度為10mg/L的卡那霉素和終濃度為250mg/L的頭 孢霉素。
[0042] 采用上述進(jìn)一步方案的有益效果是：在本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)化方法中選擇了合適的 轉(zhuǎn)化條件以及使用試劑的濃度，具有較高再生頻率以及較高的轉(zhuǎn)化頻率，成功的制備了轉(zhuǎn) CitPSY的草莓，并且在后續(xù)的培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)假陽性率比較低。
[0043] 上述步驟c)中的含有抗生素的液體培養(yǎng)基指適于培養(yǎng)含有柑橘八氫番茄紅素合 成酶基因表達(dá)質(zhì)粒的農(nóng)桿菌，可以根據(jù)含有柑橘八氫番茄紅素合成酶基因表達(dá)質(zhì)粒所攜帶 的抗性基因選用合適的抗生素以及濃度，本實(shí)施中使用的含有抗生素的液體培養(yǎng)基為含有 Kan的濃度為50mg/L的LB液體培養(yǎng)基。
【附圖說明】
[0044] 圖1為本發(fā)明所述質(zhì)粒pBI121-Cit-PSY表達(dá)載體T-DNA區(qū)示意圖，其中：LB代表 T-DNA左邊界；RB代表T-DNA右邊界；npt II代表新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II基因；
[0045] 圖2包括圖2A和圖2B，圖2A為本發(fā)明所述提高草莓花青素含量的方法的過程示 意圖；圖2B為本發(fā)明所述根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)草莓葉片遺傳轉(zhuǎn)化過程示意圖；
[0046] 圖3為本發(fā)明所述轉(zhuǎn)基因陽性株系PCR擴(kuò)增CitPSY基因結(jié)果，其中：M為lkb DNA ladder ;Q為CitPSY質(zhì)粒；c為非轉(zhuǎn)基因草莓對(duì)照；條帶1-14為抗性草莓植株；
[0047] 圖4為利用HPLC測定不同草莓株系中花青素色譜圖，包括圖4A至4F ;其中，縱 坐標(biāo)為含量（AU)，橫坐標(biāo)為時(shí)間（單位為分鐘）；圖4A至4F分別是利用HPLC測定甜查理、 金玉、紅顏、章姬、PMV株系、4-1株系的花