br>[0104] 對比實施例2-2
[0105] 步驟（9)中，將草莓葉片接種于再生培養(yǎng)基上，置于暗室培養(yǎng)，暗處理時間分別 為：7d、14d、21d、28d和35d。其余步驟同實施例2。
[0106] 對比實施例2-3
[0107] 步驟⑶中，將葉片接種在不同Kan濃度的篩選培養(yǎng)基上，每20d繼代一次，觀察 不定芽再生情況，選出使葉片再生愈傷但不能再生不定芽的最低Kan濃度，設置以下濃度 處理：0mg/L、10mg/L、20mg/L、30mg/L 和 40mg/L。其余步驟同實施例 2。
[0108] 對比實施例2-4
[0109] 步驟（8)中，用0D600 = 0. 4的農(nóng)桿菌菌液侵染葉盤，無菌濾紙吸干菌液后接種在 添加不同濃度Cef的篩選培養(yǎng)基上，觀察農(nóng)桿菌生長抑制效果。設置以下濃度處理：0mg/L、 100mg/L、250mg/L、400mg/L和550mg/L。并統(tǒng)計農(nóng)桿菌生長時間和生長情況。其余步驟同 實施例2。
[0110] 對比實施例2-5
[0111] 步驟⑷中將活化后的根癌農(nóng)桿菌吸出lmL，加入新配制的LB培養(yǎng)基中，分別搖 至0D600為0. 1、0. 3、0. 5、0. 7,離心后，用等體積MS液體再生培養(yǎng)基重懸，分別侵染lmin、 5min、lOmin，共培養(yǎng)3d，25d后觀察抗性愈傷生長情況。其余步驟同實施例2。
[0112] 對比實施例2-6
[0113] 步驟（2)中將葉片置于外植體再生培養(yǎng)基上預培養(yǎng)0(1、1(1、2(1、3(1、4(1，后用00600 =0. 5的菌液侵染5min，共培養(yǎng)3d，25d后觀察抗性愈傷生長情況。其余步驟同實施例2。
[0114] 對比實施例2-7
[0115] 步驟（7)中，將葉片預培養(yǎng)2d，之后用0D600 = 0? 5的菌液侵染5min，共培養(yǎng)2d、 3d、4d，脫去根癌農(nóng)桿菌后繼續(xù)培養(yǎng)，觀察抗性愈傷生長情況。其余步驟同實施例2。
[0116] 對比實施例2-8
[0117] 步驟（7)中，共培養(yǎng)3d后，被侵染的葉片分別接種于含Kan和Cef的固體外植體 再生培養(yǎng)基中立即篩選，在只含有Cef?的的推遲篩選培養(yǎng)基中推遲篩選，分別推遲篩選2d、 7d、14d，30d后統(tǒng)計觀察抗性愈傷生長和出芽情況。其余步驟同實施例2。
[0118] 通過上述方法獲得的轉入CitPSY的草莓，并進行分子生物學鑒定，鑒定結果為陽 性的菌株命名為4-1株系。
[0119] 同時按照上述方法將不含有CitPSY的空載體的質粒pBI121轉入草莓品種'全明 星'，將其命名為PMV株系。
[0120] 所述4-1株系、PMV株系的植株均保存至華中農(nóng)業(yè)大學國家柑橘育種中心。
[0121] 4-1株系與PMV株系相比，4-1株系的葉片呈現(xiàn)出淺綠色、葉片較薄、果型較小、顏 色更加鮮艷，呈深紅色。PMV株系葉片呈深綠色、葉片較厚、莖比較粗壯。
[0122] 樣品預處理
[0123] 采集4-1株系、PMV株系、甜查理、金玉、紅顏、章姬的果實（均為全紅期果實）， 用清水將果實清洗干凈，去掉果蒂，將果實平均分成三份重復，用液氮凍過后密封保存 在-80°C冰箱中，用于分子生物學鑒定和各種代謝物質的測定。
[0124] 實施例3轉基因草莓的分子生物學鑒定
[0125] 1、提取草莓DNA :采用CTAB小量法法提取葉片DNA，具體步驟見（Yun jiang Cheng, ffenwu Guo, Huai in Yi, Xiaomin Pang, Xiuxin Deng. An efficient protocol for genomic DNA extraction from Citrus species. Plant Molecular Biology Reporter, 2003, 21:177a_177g)〇
[0126] 2、利用PCR進行鑒定
[0127] 將實施例2得到14株經(jīng)Kan篩選后的抗性苗。利用CitPSY特異引物（fwd5'-CGG GATCCATGTCTGTTACA-3'，rev5'-GGGGTACCTTAAGCCTTACT-3'）（張建成.紅肉臍橙類胡蘿卜素 合成酶基因（CsPSY、CsLCYb)功能分析與crtB轉基因對類胡蘿卜素生物合成的影響.[博 士學位論文].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學，2009)，將抗性苗的葉片提取DNA，進行PCR擴增。陽性 對照為農(nóng)桿菌質粒，陰性對照為未轉基因的草莓DNA。結果如圖3所示，可看出PCR擴增后， 3個株系擴增出一條1300bp左右條帶，報告基因nptll (fwd5'-GTGCCCTGAATGAACTGC-3'，re v5'-GCCTTGAGCCTGGCGAAC-3'）（張建成.紅肉臍橙類胡蘿卜素合成酶基因（CsPSY、CsLCYb) 功能分析與crtB轉基因對類胡蘿卜素生物合成的影響.[博士學位論文].武漢：華中農(nóng)業(yè) 大學，2009)也擴增出對應條帶。
[0128] 第二年，將上述得到的陽性株系和空載株系（PMV株系）轉移到實驗大棚中，讓其 生長結果，鑒定結果為陽性的株系命名為4-1株系。
[0129] 按照表1中的反應體系配制PCR擴增反應液。
[0130] 表1PCR擴增反應液
[0131]
[0132] 按照表2中的條件運行PCR反應。
[0133] 表2PCR反應運行程序
[0134]
[0135] 對比實施例3-1
[0136] 分別以PMV株系、甜查理、金玉、紅顏、章姬的果實（均為全紅期果實）作為對照， 進行對比實施例。具體操作過程同實施例3。
[0137] 所述甜查理、金玉、紅顏、章姬購自于湖北省農(nóng)業(yè)科學院經(jīng)濟作物研究所基地大 棚。
[0138] 實施例4
[0139] 利用HPLC測定花青素含量，具體步驟可以參照Bordonaba JG, Terry LA. Biochemical profiling and chemometric analysis of seventeen UK-grown black currant cultivars.Agricul tural and Food Chemistry, 2008, 56(16) :7422_7430所述的 方法。
[0140] 1)將樣品用液氮研磨，準確稱取lg樣品到lOmL離心管中。
[0141] 2)向離心管中加入5mL的提取液（所述提取液為鹽酸和甲醇溶液的混合液，其中 鹽酸的體積分數(shù)為1 % )，渦旋2min。
[0142] 3)將渦旋后的試管放入超聲儀中超聲40min。
[0143] 4)超聲后5000g離心10min，過0. 22 y m的濾膜，準備上樣。
[0144] 其中，色譜柱為4. 6mmX250mm，5ym(Sigma，USA);流動相A為水（含有質量分數(shù) 為1 %的甲醇），流動相B為甲醇，流速為lmL/min。
[0145] 具體洗脫條件參見表3。
[0146] 表3 HPLC測定花青素的洗脫條件
[0147]
[0148] 選擇天竺葵-3-0-葡萄糖苷（The nature network, 97% )、矢車菊-3-0-葡萄糖 苷（上?；莩巧?，98 % )作為標準品，分別稀釋成512、256、128、64、32、16、8、4、2、1 y g/ ml。做出標準曲線，得出定量公式及R值。
[0149] 對比實施例4
[0150] 分別以PMV株系、甜查理、金玉、紅顏、章姬的果實（均為全紅期果實）作為對照， 進行對比實施例。具體操作過程同實施例4。
[0151] 實施例5與花青素相關基因表達分析
[0152] 1. RNA反轉錄成單鏈cDNA:參照RevertAid M-MuLV KIT的方法。以1-1. 5 y g mRNA 作為模板進行反轉錄，完成后的cDNA加80 y L ddH20稀釋；
[0153] 2.根據(jù)已報道文獻，利用Primer 5和Primer Express軟件設計實時焚光定量 PCR引物，其中CHS fwd5 ' -CCGACTACTACTITCGTATCACCA-3 '，rev5 ' -ACTACCACCATGTCTTGTCTT GC-3' ；CHI fwd5' -TTTTCAATGGCTTTCGCTTCTG-3'，rev5' -GTGACAATGATACTACCGCTGACG-3'； F3H fwd5' -GTGCGCCACCGTGACTACTC-3'，rev5' -ATGCCTTTGTCAATGCCTCC-3' ；DFR fwd5' -GGGTGGTGTTTACATCTTCGG-3'，rev5' -CTGCTTGCTCGGCTAGAGTTT-3'；ANS fwd5' -ATCGTCATGC ACATAGGCGACACC-3'，rev5' -CCTTGGGCGGCTCACAGAAAA-3'；UFGT fwd5' -ATCGTGGCTTGACAAA CAGAA-3'，rev5' -TGACCACAAGAATGGAACCCTA-3'；MYBlfwd5' -ATGAGGAAGCCCTGCTGCGA-3'，r ev5'-AACGACGCAACCCTGCAGCC-3'（可以參考文獻：Salvatierra A, Pimentel P，Moya-le6n MA, Herrera R. Increased accumulation of anthocyanins in Fragariachiloensis fruits by transient suppression of FcMYBlgene. Phytochemistry, 2013, 90:25-36.)； MYB10fwd5' -TCAAATCAGGCTTAAACAGA-3'，rev5' -TTAAAGACCACCTGTTTCCT-3'；bHLH3fwd5 ' -ACCGAGTAGTAGCAGACTCCGTGGTAT-3'，rev5' -CCATCTGCCCATATTAACATCCCTTG-3'；bHLH33f wd5' -AATCCATGAGAGGGTGCCTGAGAAT-3'，rev5' -CAGCACCCCTTGTTG