一種冬蟲夏草固體發(fā)酵液中多糖的提取方法
【專利說明】一種冬蟲夏草固體發(fā)酵液中多糖的提取方法
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種冬蟲夏草固體發(fā)酵液中多糖的提取方法。
【背景技術(shù)】
[0003]冬蟲夏草是麥角菌科真菌，它寄生于蟲草蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上的子座及幼蟲尸體上。冬蟲夏草首載于本草從新，味甘，性溫，歸肺，腎經(jīng)，具有具有多種生理活性，如補虛損、益精氣、保肺、益腎、止血化痰、滋補強壯、抗氧化、提高免疫力等，因此，常用來治療勞咳痰血、盜汗、陽痿、遺精、黃膽病、肺結(jié)核及老年衰弱、慢性咳喘等癥。一直以來，冬蟲夏草一直被視為珍貴的中藥材。
[0004]蟲草多糖是蟲草中含量最高的生物活性物質(zhì)，具有抗腫瘤、抗氧化、提高免疫力、降低血脂等廣泛的藥理作用，目前，市面上的“金水寶膠囊”、“寧心寶膠囊”、“蟲草菌膠囊”、“百令膠囊”等產(chǎn)品中起主要作用的就是蟲草多糖。但由于冬蟲夏草對生長環(huán)境要求較高，自然野生的產(chǎn)量相當(dāng)有限，為此，如何對對冬蟲夏草中的多糖活性成分進行高效提取，是目前國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點?，F(xiàn)有的冬蟲夏草多糖提取技術(shù)主要包括超聲波法、水提醇沉法及超臨界二氧化碳萃取法，但上述方法存在各自的缺陷或不足，例如水提醇沉法提取率低，多糖純度不足。為此，本發(fā)明提供一種改進的冬蟲夏草胞內(nèi)多糖提取方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問題，提供一種冬蟲夏草固體發(fā)酵液中多糖的提取方法，多糖得率高，操作簡便。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
一種冬蟲夏草固體發(fā)酵液中多糖的提取方法，包括以下步驟:
(1)樣品前處理:將保藏好的冬蟲夏草菌種5-10g經(jīng)清水沖洗、烘干后，備用；
(2)配制固體發(fā)酵培養(yǎng)基:取葡萄糖2-5g，玉米粉2-4g，氮源l-2g，麥麩2-4g，KH2PO4
2-4g, MgSO4 l_2g，Vitamin B1 2_4g，Vitamin B2 3_6g，培養(yǎng)基中加入蒸饋水，加熱煮沸，調(diào)節(jié)PH，趁熱倒入容器中，高壓蒸汽滅菌，倒在平板上；
(3)發(fā)酵培養(yǎng):將步驟(I)中經(jīng)樣品前處理后的樣品接種到步驟(I)中制備好的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)完成后取菌種發(fā)酵液備用；
(4)取步驟(3)中制得的菌種發(fā)酵液加水進行超聲回流提取，經(jīng)0.45um微孔濾膜過濾，取樣品濾液備用；
(5)將步驟(4)中制備的樣品濾液蒸發(fā)濃縮至原體積的1/3-1/2，再加乙醇進行醇沉，經(jīng)過濾后，冷凍離心，取上清液在4°C條件下靜置12h，在常溫下離心，經(jīng)0.45um微孔濾膜過濾得沉淀，采用無水乙醇洗滌1-3次，濃縮得到樣品粗多糖； (6)將步驟(5)中制得的樣品粗多糖采用添加活性碳的沸水溶解脫色，冷卻，再加沸水，再冷卻，去除蛋白，將去除蛋白的樣品溶液置入透析袋中，在蒸餾水中透析24h，將5-10倍體積的乙醇加入透析后的溶液中，在4°C條件下沉淀過夜，離心，棄上清，取沉淀物干燥，制得精多糖。
[0007]優(yōu)選的，步驟(I)與步驟(6)中所述的烘干溫度均為50_80°C。
[0008]優(yōu)選的，步驟(2)中加蒸餾水的量是按料水比(1-3): (1.5-5)的體積加入的。
[0009]優(yōu)選的，步驟(2)中調(diào)節(jié)PH為調(diào)節(jié)PH至6.5-7.2。
[0010]優(yōu)選的，步驟(2)中所述的高壓蒸汽滅菌時間為10_20min。
[0011]優(yōu)選的，步驟(3)中所述的培養(yǎng)溫度為25_28°C，培養(yǎng)為無光照培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為5-7do
[0012]優(yōu)選的，步驟(4)中所述的超聲回流提取溫度為80-100°C，提取時間為每次l_2h，提取次數(shù)為3-5次。
[0013]優(yōu)選的，步驟(5)中所述的冷凍離心溫度為-10- _4°C，步驟(5)中兩次離心及步驟(6)中的離心速度均為4000-8000r/min，離心時間均為10_20min。
[0014]優(yōu)選的，步驟(6)中所述的添加活性碳的沸水中，活性碳的質(zhì)量濃度為1_3%。
[0015]優(yōu)選的，步驟(6)中所述的透析膜為截留分子量為6000-8000的半透膜，所述的乙醇濃度為65-80%。
[0016]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，有益效果體現(xiàn)在:
1.氮源是蟲草菌生長所必需的營養(yǎng)元素，由于蟲草菌在原寄主蝙蝠蛾幼蟲體內(nèi)長期寄生，已適應(yīng)對動物類蛋白的吸收利用，而對植物類蛋白吸收較差，導(dǎo)致其有效成分的含量及生物量低于動物氮源。因此，本發(fā)明中將蛋白胨或蠶蛹粉等作為固態(tài)培養(yǎng)基的氮源，可提高蟲草菌絲體及其主要有效成分的含量
2.本發(fā)明對固態(tài)培養(yǎng)基的成分進行了嚴(yán)格優(yōu)化，對固態(tài)培養(yǎng)時的培養(yǎng)溫度、料水比及光照等培養(yǎng)條件也進行了嚴(yán)格控制，對冬蟲夏草菌絲體生長更有利，可明顯提高菌絲體中的主要有效成分之一麥留醇的含量。
[0017]3.多糖類成分的提取常采用熱水、溶劑(酸、堿或乙醇)浸提法，本發(fā)明先將樣品進行預(yù)處理，將樣品發(fā)酵液進行濃縮，加乙醇進行精制，且將乙醇濃度限制為65-80%，可使冬蟲夏草胞外多糖醇沉效果最好。
[0018]4.冬蟲夏草發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)會影響其中多糖的是率及含量測定，因此，在蟲草多糖提取過程中，常需要采取措施去除其中的蛋白質(zhì)，研究顯示，sevage法清除蛋白質(zhì)效果最好，且多糖得率也最高，但因氯仿毒性較大，因此，不適宜冬蟲夏草的實際生產(chǎn)應(yīng)用，而三氯乙酸法多糖得率低，且脫蛋白效果也不明顯，為此，本發(fā)明采用添加有一定濃度的活性碳沸水脫色后，加熱、冷卻法去除蛋白，操作簡便，效果好，且不影響多糖的多率。
【具體實施方式】
[0019]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行詳細說明:
實施例1
一種冬蟲夏草固體發(fā)酵液中多糖的提取方法，包括以下步驟:
(I)樣品前處理:將保藏好的冬蟲夏草菌種5g經(jīng)清水沖洗、在50°C下烘干后，備用； (2)配制固體發(fā)酵培養(yǎng)基:取葡萄糖2g，玉米粉2g，氮源lg，麥麩2g，KH2PO4 2g，MgSO4lg，Vitamin B1 2g，Vitamin B2 3g，培養(yǎng)基中加入蒸饋水，加熱煮沸，調(diào)節(jié)PH至6.5，趁熱倒入容器中，高壓蒸汽滅菌lOmin，倒在平板上；
(3)發(fā)酵培養(yǎng):將步驟(I)中經(jīng)樣品前處理后的樣品接種到步驟(I)中制備好的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為25°C，培養(yǎng)為無光照培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為5d，培養(yǎng)完成后取菌種發(fā)酵液備用；
(4)取步驟(3)中制得的菌種發(fā)酵液加水在80°C下進行超聲回流提取3次，每次lh，經(jīng)
0.45um微孔濾膜過濾，取樣品濾液備用；
(5)將步驟(4)中制備的樣品濾液蒸發(fā)濃縮至原體積的1/3，再加乙醇進行醇沉，經(jīng)過濾后，在-10°C以4000r/min冷凍離心lOmin，取上清液在4°C條件下靜置12h，在常溫下以4000r/min離心lOmin，經(jīng)0.45um微孔濾膜過濾得沉淀，采用無水乙醇洗滌I次，濃縮得到樣品粗多糖；
(6)將步驟(5)中制得的樣品粗多糖采用添加1%活性碳的沸水溶解脫色，冷卻，再加沸水，再冷卻，去除蛋白，將去除蛋白的樣品溶液置入透析袋中，在蒸餾水中透析24h，將5倍體積的65%乙醇加入透析后的溶液中，在4°C條件下沉淀過夜，離心，棄上清，取沉淀物干燥，制得精多糖。
[0020]步驟(2)中加蒸餾水的量是按料水比1: 1.5的體積加入的。
[0021]步驟(6)中所述的透析膜為截留分子量為6000的半透膜。
[0022]
實施例2
一種冬蟲夏草固體發(fā)酵液中多糖的提取方法，包括以下步驟:
(1)樣品前處理:將保藏好的冬蟲夏草菌種1g經(jīng)清水沖洗、在80°C下烘干后，備用；<