br> (2)配制固體發(fā)酵培養(yǎng)基:取葡萄糖5g，玉米粉4g，氮源2g，麥麩4g，KH2P044g, MgSO42g，Vitamin B^gjVitamin B26g，培養(yǎng)基中加入蒸饋水，加熱煮沸，調(diào)節(jié)PH至7.2，趁熱倒入容器中，高壓蒸汽滅菌20min，倒在平板上；
(3)發(fā)酵培養(yǎng):將步驟(I)中經(jīng)樣品前處理后的樣品接種到步驟(I)中制備好的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為28°C，培養(yǎng)為無光照培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為7d，培養(yǎng)完成后取菌種發(fā)酵液備用；
(4)取步驟(3)中制得的菌種發(fā)酵液加水在100°C下進(jìn)行超聲回流提取5次，每次2h，經(jīng)0.45um微孔濾膜過濾，取樣品濾液備用；
(5)將步驟(4)中制備的樣品濾液蒸發(fā)濃縮至原體積的1/2，再加乙醇進(jìn)行醇沉，經(jīng)過濾后，在_4°C以8000r/min冷凍離心20min，取上清液在4°C條件下靜置12h，在常溫下以8000r/min離心20min，經(jīng)0.45um微孔濾膜過濾得沉淀，采用無水乙醇洗滌3次，濃縮得到樣品粗多糖；
(6)將步驟(5)中制得的樣品粗多糖采用添加3%活性碳的沸水溶解脫色，冷卻，再加沸水，再冷卻，去除蛋白，將去除蛋白的樣品溶液置入透析袋中，在蒸餾水中透析24h，將10倍體積的80%乙醇加入透析后的溶液中，在4°C條件下沉淀過夜，離心，棄上清，取沉淀物干燥，制得精多糖。
[0023]步驟(2)中加蒸餾水的量是按料水比3:5的體積加入的。
[0024]步驟(6)中所述的透析膜為截留分子量為8000的半透膜。
[0025] 實施例3
一種冬蟲夏草固體發(fā)酵液中多糖的提取方法，包括以下步驟:
(1)樣品前處理:將保藏好的冬蟲夏草菌種Sg經(jīng)清水沖洗、在65°C下烘干后，備用；
(2)配制固體發(fā)酵培養(yǎng)基:取葡萄糖3g，玉米粉3g，氮源1.5g，麥麩3 g，KH2P043g, MgSO4 1.5g, Vitamin B1 3g, Vitamin B2 4.5g，培養(yǎng)基中加入蒸饋水，加熱煮沸，調(diào)節(jié)PH至6.8，趁熱倒入容器中，高壓蒸汽滅菌15min，倒在平板上；
(3)發(fā)酵培養(yǎng):將步驟(I)中經(jīng)樣品前處理后的樣品接種到步驟(I)中制備好的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為26°C，培養(yǎng)為無光照培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為6d，培養(yǎng)完成后取菌種發(fā)酵液備用；
(4)取步驟(3)中制得的菌種發(fā)酵液加水在90°C下進(jìn)行超聲回流提取4次，每次1.5h，經(jīng)0.45um微孔濾膜過濾，取樣品濾液備用；
(5)將步驟(4)中制備的樣品濾液蒸發(fā)濃縮至原體積的1/3，再加乙醇進(jìn)行醇沉，經(jīng)過濾后，在-8°C以6000r/min冷凍離心15min，取上清液在4°C條件下靜置12h，在常溫下以6000r/min離心15min，經(jīng)0.45um微孔濾膜過濾得沉淀，采用無水乙醇洗滌2次，濃縮得到樣品粗多糖；
(6)將步驟(5)中制得的樣品粗多糖采用添加2%活性碳的沸水溶解脫色，冷卻，再加沸水，再冷卻，去除蛋白，將去除蛋白的樣品溶液置入透析袋中，在蒸餾水中透析24h，將8倍體積的70%乙醇加入透析后的溶液中，在4°C條件下沉淀過夜，離心，棄上清，取沉淀物干燥，制得精多糖。
[0026]步驟(2)中加蒸餾水的量是按料水比2:3的體積加入的。
[0027]步驟(6)中所述的透析膜為截留分子量為7000的半透膜。
[0028]
上述實施例僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，并不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限定，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的揭示，不脫離本發(fā)明范疇所做出的改進(jìn)和修改都應(yīng)該在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1.一種冬蟲夏草固體發(fā)酵液中多糖的提取方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)樣品前處理:將保藏好的冬蟲夏草菌種5-10g經(jīng)清水沖洗、烘干后，備用； (2)配制固體發(fā)酵培養(yǎng)基:取葡萄糖2-5g，玉米粉2-4g，氮源l-2g，麥麩2-4g，KH2PO42-4g, MgSO4 l_2g，Vitamin B1 2_4g，Vitamin B2 3_6g，培養(yǎng)基中加入蒸饋水，加熱煮沸，調(diào)節(jié)PH，趁熱倒入容器中，高壓蒸汽滅菌，倒在平板上； (3)發(fā)酵培養(yǎng):將步驟(I)中經(jīng)樣品前處理后的樣品接種到步驟(I)中制備好的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)完成后取菌種發(fā)酵液備用； (4)取步驟(3)中制得的菌種發(fā)酵液加水進(jìn)行超聲回流提取，經(jīng)0.45um微孔濾膜過濾，取樣品濾液備用； (5)將步驟(4)中制備的樣品濾液蒸發(fā)濃縮至原體積的1/3-1/2，再加乙醇進(jìn)行醇沉，經(jīng)過濾后，冷凍離心，取上清液在4°C條件下靜置12h，在常溫下離心，經(jīng)0.45um微孔濾膜過濾得沉淀，采用無水乙醇洗滌1-3次，濃縮得到樣品粗多糖； (6)將步驟(5)中制得的樣品粗多糖采用添加活性碳的沸水溶解脫色，冷卻，再加沸水，再冷卻，去除蛋白，將去除蛋白的樣品溶液置入透析袋中，在蒸餾水中透析24h，將5-10倍體積的乙醇加入透析后的溶液中，在4°C條件下沉淀過夜，離心，棄上清，取沉淀物干燥，制得精多糖。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種冬蟲夏草固體發(fā)酵液中多糖的提取方法，其特征在于，步驟(I)與步驟(6)中所述的烘干溫度均為50-80°C。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種冬蟲夏草固體發(fā)酵液中多糖的提取方法，其特征在于，步驟(2)中加蒸餾水的量是按料水比(1-3): (1.5-5)的體積加入的。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種冬蟲夏草固體發(fā)酵液中多糖的提取方法，其特征在于，步驟(2)中調(diào)節(jié)PH為調(diào)節(jié)PH至6.5-7.2。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種冬蟲夏草固體發(fā)酵液中多糖的提取方法，其特征在于，步驟(2)中所述的高壓蒸汽滅菌時間為10-20min。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種冬蟲夏草固體發(fā)酵液中多糖的提取方法，其特征在于，步驟(3)中所述的培養(yǎng)溫度為25-28°C，培養(yǎng)為無光照培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為5-7d。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種冬蟲夏草固體發(fā)酵液中多糖的提取方法，其特征在于，步驟(4)中所述的超聲回流提取溫度為80-100°C，提取時間為每次l_2h，提取次數(shù)為3-5次。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種冬蟲夏草固體發(fā)酵液中多糖的提取方法，其特征在于，步驟(5)中所述的冷凍離心溫度為-10- -4°C，步驟(5)中兩次離心及步驟(6)中的離心速度均為4000-8000r/min，離心時間均為10_20min。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種冬蟲夏草固體發(fā)酵液中多糖的提取方法，其特征在于，步驟(6)中所述的添加活性碳的沸水中，活性碳的質(zhì)量濃度為1_3%。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種冬蟲夏草固體發(fā)酵液中多糖的提取方法，其特征在于，步驟(6)中所述的透析膜為截留分子量為6000-8000的半透膜，所述的乙醇濃度為65-80%。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種冬蟲夏草固體發(fā)酵液中多糖的提取方法，所述的提取方法包括以下步驟：樣品前處理、配制固體發(fā)酵培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)制備菌種發(fā)酵液、超聲回流提取、制備樣品粗多糖、制備精多糖。本發(fā)明先對樣品進(jìn)行預(yù)處理、然后優(yōu)化固態(tài)培養(yǎng)基的組分、培養(yǎng)溫度、料水比及光照等培養(yǎng)條件，對冬蟲夏草菌絲體生長更有利，可明顯提高菌絲體中的主要有效成分之一麥甾醇的含量；在多糖提取時，先采用加有活性碳的沸水脫色，并采用加熱、冷卻法去除蛋白，操作簡便，效果好，且不影響多糖得率；在采用乙醇進(jìn)行醇沉?xí)r，采用65-80%的乙醇，多糖醇沉效果最好；整個操作簡便、不需要特殊儀器及設(shè)備，適宜大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用。
【IPC分類】C08B37/00, C12R1/645, C12P19/04
【公開號】CN105039452
【申請?zhí)枴緾N201510345913
【發(fā)明人】郭狄
【申請人】中山鼎晟生物科技有限公司
【公開日】2015年11月11日
【申請日】2015年6月23日