熱化學(xué)處理與微生物發(fā)酵和酶解聯(lián)合降解和糖化農(nóng)作物秸稈的新工藝的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于農(nóng)作物秸桿處理技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種熱化學(xué)處理與微生物發(fā)酵和 酶解聯(lián)合降解和糖化農(nóng)作物秸桿的新工藝。
【背景技術(shù)】
[0002] 秸桿木質(zhì)纖維素作為結(jié)構(gòu)碳水化合物是自然界存在的數(shù)量巨大的可再生資源。然 而，因缺乏有效的處理方法，大部分秸桿資源都作為廢棄物被焚燒或埋置于農(nóng)田。秸桿主要 是由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成，通過微生物發(fā)酵和酶解能將纖維素和半纖維素轉(zhuǎn)化 成葡萄糖單體、乙醇、糠醛、動(dòng)物飼料、能量和其它化學(xué)原料。但是木質(zhì)素復(fù)雜的三維高分子 網(wǎng)狀芳香類聚合物阻礙纖維素酶接近纖維素聚合物。因此，怎樣去分解木質(zhì)素以提高纖維 素聚合物酶解效率至關(guān)重要。
[0003]目前，"人畜爭(zhēng)糧"矛盾日益激烈，特別是在世界人口迅速增長(zhǎng)的今天，如何解決這 個(gè)矛盾變得越來(lái)越重要。將秸桿中纖維素和半纖維素作為結(jié)構(gòu)性碳水化合物轉(zhuǎn)變成葡萄 糖替代動(dòng)物飼料中的能量原料是可行的。Chang等（2012)和Guo等（2013)報(bào)道玉米秸桿 通過物理處理和微生物發(fā)酵可以轉(zhuǎn)變成動(dòng)物飼料，這將有助于解決畜牧生產(chǎn)中飼料短缺問 題。
[0004] 關(guān)于木質(zhì)素裂解和提高秸桿實(shí)用性的方法很多，比如酸、堿、蒸汽爆破和有機(jī)溶劑 處理已經(jīng)用于秸桿以提高酶解效率。通常高濃度化學(xué)處理(強(qiáng)酸、強(qiáng)堿）效果優(yōu)于低濃化學(xué) 處理(弱酸、弱堿)。但是秸桿作為動(dòng)物飼料開發(fā)，高濃度化學(xué)處理不僅會(huì)損害動(dòng)物的健康， 還因需要大量的水沖洗處理產(chǎn)物，造成了環(huán)境污染和成本增加。前人報(bào)道了關(guān)于酸和堿處 理秸桿生產(chǎn)乙醇的研究并取得顯著成就，但是因化學(xué)離子（Na +，Ca2+和C1 )超出動(dòng)物營(yíng)養(yǎng) 標(biāo)準(zhǔn)不適用于飼料生產(chǎn)。二甲基亞砜、N，N-二甲基甲酰胺和1，3-二甲基-2-咪唑烷酮等 有機(jī)溶劑可作為共溶劑來(lái)處理秸桿，但是這些處理因有毒有害化學(xué)物質(zhì)加入對(duì)動(dòng)物健康有 害。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷，提供一種熱化學(xué)處理與微生物發(fā)酵和酶解聯(lián) 合降解和糖化農(nóng)作物秸桿的新工藝。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案： 一種熱化學(xué)處理與酶解聯(lián)合降解和糖化農(nóng)作物秸桿的新工藝，其包括如下步驟： 1) 將粉碎過的農(nóng)作物秸桿與浸泡液按固液比lg :9 - 13ml混合后，于70 - 90°C保溫 處理6 - 18h，保溫處理結(jié)束后添加浸泡液體積3%的雙氧水于50°C保持6 - 18h，取出，烘 干；所述浸泡液為含有氫氧化鈉的石灰上清液，氫氧化鈉用量為農(nóng)作物秸桿重量的2%，石 灰為農(nóng)作物猜桿重量的5 - 15% ; 2) 以5g秸桿添加100ml蒸餾水計(jì)，將步驟1)所得秸桿轉(zhuǎn)入到蒸餾水中，然后加入纖 維素酶20 - 60 FPU/g猜桿和木聚糖酶300 - 600 U/g猜桿，調(diào)整pH至4 一 5,然后于在 45 - 50°C搖床酶解24 - 48 h，酶解結(jié)束后100°C處理30 min以終止酶解反應(yīng)，酶解產(chǎn)物 烘干，粉碎，即得。
[0007] -種熱化學(xué)處理與微生物發(fā)酵聯(lián)合降解和糖化農(nóng)作物秸桿的新工藝，其包括如下 步驟： 1) 將粉碎過的農(nóng)作物秸桿與浸泡液按固液比lg :9 - 13ml混合后，于70 - 90°C保溫 處理6 - 18h，保溫處理結(jié)束后添加浸泡液體積3%的雙氧水于50°C保持6 - 18h，取出，烘 干；所述浸泡液為含有氫氧化鈉的石灰上清液，氫氧化鈉用量為農(nóng)作物秸桿重量的2%，石 灰用量為農(nóng)作物猜桿重量的5 - 15% ; 2) 取5g步驟1)所得秸桿，加入10 mL、1 X 106- 1 X 10 7 CFU/ml康寧木霉孢子懸浮液， 28 - 32°C發(fā)酵培養(yǎng)5 - 7天.，發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)物烘干，粉碎，即得。
[0008] 較好的，一種熱化學(xué)處理與微生物發(fā)酵和酶解聯(lián)合降解和糖化農(nóng)作物秸桿的新工 藝，其包括如下步驟： 1) 將粉碎過的農(nóng)作物秸桿與浸泡液按固液比lg :9 - 13ml混合后，于70 - 90°C保溫 處理6 - 18h，保溫處理結(jié)束后添加浸泡液體積3%的雙氧水于50°C保持6 - 18h，取出，烘 干；所述浸泡液為含有氫氧化鈉的石灰上清液，氫氧化鈉用量為農(nóng)作物秸桿重量的2%，石 灰用量為農(nóng)作物猜桿重量的5 - 15% ; 2) 取5g步驟1)所得秸桿，加入10 mL、1 X 106- 1 X 10 7 CFU/ml康寧木霉孢子懸浮液， 28 - 32°C發(fā)酵培養(yǎng)5 - 7天.，發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)物烘干，粉碎； 3) 以5g秸桿添加100ml蒸餾水計(jì)，將步驟2)所得秸桿轉(zhuǎn)入到蒸餾水中，然后加入纖 維素酶20 - 60 FPU/g猜桿和木聚糖酶300 - 600 U/g猜桿，調(diào)整pH至4 一 5,然后于在 45 - 50°C搖床酶解24 - 48 h，酶解結(jié)束后100°C處理30 min以終止酶解反應(yīng)，酶解產(chǎn)物 烘干，粉碎，即得。
[0009] 所述農(nóng)作物秸桿可以是玉米秸桿、小麥秸桿等。本申請(qǐng)以玉米秸桿為例進(jìn)行研究。
[0010] 為了避免現(xiàn)有處理方法中存在的弊端，本申請(qǐng)根據(jù)NRC (1994)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)要 求，選擇低濃度氫氧化鈉和石灰來(lái)處理玉米秸桿。因?yàn)镃a2+和Na +是動(dòng)物必需的礦物元素， 動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)中關(guān)于家禽對(duì)Ca2+和Na+需求分別為0. 8 - 2. 0%和0. 12 - 0. 2%?；瘜W(xué)處 理秸桿中殘留的Ca2+和Na +可以被動(dòng)物吸收，以減少飼糧配方中石粉和食鹽的添加。高溫 處理（> 10(TC )對(duì)設(shè)備要求嚴(yán)格，部分纖維素和半纖維素分解成還原糖，會(huì)進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成 糠醛、甲酸和丙酸等副產(chǎn)物，不僅影響動(dòng)物健康，還對(duì)酶解產(chǎn)生抑制作用，因此本申請(qǐng)選擇 處理溫度<l〇〇°C。本申請(qǐng)通過響應(yīng)面設(shè)計(jì)獲得最優(yōu)的石灰濃度和處理?xiàng)l件，并對(duì)石灰、氫氧 化鈉和雙氧水進(jìn)行單一和復(fù)合對(duì)比分析。此外，為更進(jìn)一步提高秸桿的降解率和糖化率，對(duì) 微生物發(fā)酵和酶解的條件也進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，玉米秸桿以液固比13:1 (mL/g)浸泡 在15% (w/w)石灰上清液和2% (w/w)氫氧化鈉組成的混合溶液中，在83. 92°C條件下保持 6 h;隨后添加3% (v/v) H202,在50°C條件下保持2 h;最后添加纖維素酶（32. 3 FPU/g干 物質(zhì)）和木聚糖酶（550 U/g干物質(zhì)），50°C搖床酶解48 h，得到最大還原糖產(chǎn)量為348. 77 mg/g。與原始的酶解秸桿相比，化學(xué)處理后再酶解的秸桿中還原糖產(chǎn)量提高126. 42% (P〈 0. 05)，纖維素，半纖維素和木質(zhì)素降解率分別提高40. 08% (P〈 0. 05)，45. 71% (P〈 0. 05) 和52. 01%(P〈 0.05)。秸桿經(jīng)化學(xué)處理后，再經(jīng)微生物發(fā)酵和酶解聯(lián)合處理，可進(jìn)一步提 高秸桿的降解率和還原糖產(chǎn)量（442.85 mg/g，P〈 0.05)。
【附圖說(shuō)明】
[0011] 圖1為不同玉米秸桿樣品的掃描電鏡圖像；圖中，（A)未處理玉米秸桿；⑶化學(xué) 處理（15%Ca0+2%Na0H+3%H 202)玉米秸桿；（C)化學(xué)處理+康寧木霉發(fā)酵+酶解聯(lián)合處理秸 桿。
【具體實(shí)施方式】
[0012] 以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步地詳細(xì)介紹，但本發(fā)明的保護(hù)范圍 并不局限于此。 實(shí)施例
[0013] 1?材料與方法 1. 1材料 自然風(fēng)干玉米秸桿經(jīng)錘片式粉碎機(jī)粉碎，過篩1 _，室溫保存。纖維素酶和木聚糖酶購(gòu) 于山東澤生生物技術(shù)有限公司。根據(jù)美國(guó)可再生能源實(shí)驗(yàn)室（NREL)纖維素酶測(cè)定方法測(cè) 定纖維素酶活和木聚糖酶活分別為323 FPU/g和5500 U/g?？祵幠久官?gòu)自中國(guó)普通微生物 菌種保藏管理中心，菌種編號(hào)CGMCC 3. 4262。
[0014] 1. 2最佳化學(xué)處理?xiàng)l件響應(yīng)面設(shè)計(jì) 利用Design-Expert 8.0.5軟件，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)用于試驗(yàn)設(shè)計(jì)，模型擬合和 數(shù)據(jù)分析。試驗(yàn)取15g玉米秸桿裝入500 ml燒杯中用錫箱紙密封，用水浴鍋進(jìn)行保溫處 理。響應(yīng)面優(yōu)化基于前期單因素處理結(jié)果，各因素選擇范圍為處理溫度70-90°C ;處理時(shí)間 6-18 h ;石灰上清液的濃度5 - 15% (w/w，石灰/猜桿);液固比為9:1-13:1，試驗(yàn)因素及水 平表見表1。在石灰處理的同時(shí)添加2%氫氧化鈉（w/w，氫氧化鈉/秸桿)，氫氧化鈉濃度的 選擇是根據(jù)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)中家禽對(duì)N