用于產(chǎn)生(r)-3-奎寧環(huán)醇的生物催化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于產(chǎn)生高光學(xué)純度（R)-3-奎寧環(huán)醇（(3R)-1-氮雜雙環(huán) [2. 2. 2]辛-3-醇，CAS# :25333-42-0)或其鹽（CAS# :42437-96-7)的方法，
[0002]
[0003] (R) -3-奎寧環(huán)醇[(3R) -1-氮雜雙環(huán)[2. 2. 2]辛-3-醇]
[0004] 所述方法包括通過使用NADH作為輔因子，使奎寧環(huán)-3-酮與新氧化還原酶反應(yīng)。
【背景技術(shù)】
[0005] (R)-3_奎寧環(huán)醇是合成一系列眾多藥物的寶貴中間體。在制藥業(yè)中，它例如用 作認(rèn)知增強藥他沙利定、尿失禁藥索利那辛或治療哮喘用M3拮抗劑瑞伐托酯的手性合 成子。存在已知獲得光學(xué)活性奎寧環(huán)醇的不同方法，如使用金屬催化劑的化學(xué)還原反應(yīng) (參考JPH9-194480A)、通過酶促水解反應(yīng)拆分（±)-3_奎寧環(huán)醇酯外消旋混合物（參考 US5215918B、JPH10-136995A、JPH10-210997A、JPH9-194480A)，和使用完整細(xì)胞生物催化 劑或分離的酶將奎寧環(huán)-3-酮酶促還原（參考JP10243795、JP11196890、JP2002153293、 JP2000245495)〇
[0006] 通過用金屬催化劑還原制備光學(xué)純（R)-3-奎寧環(huán)醇據(jù)報道提供不充分的工業(yè)應(yīng) 用有效性，因為還原產(chǎn)物的光學(xué)純度低并需要額外的純化步驟以獲得純對映異構(gòu)體。
[0007] 通過用蛋白酶拆分（±)_3_奎寧環(huán)醇酯的外消旋混合物制備光學(xué)純（R)-3_奎寧 環(huán)醇也不適用于工業(yè)應(yīng)用，原因在于必需從反應(yīng)混合物除去剩余酯及與之相關(guān)的高成本。
[0008] 已經(jīng)對如下屬的細(xì)胞報道了通過借助完整生物轉(zhuǎn)化以酶促方式還原奎寧 環(huán)-3-酮而制備光學(xué)純（R)-3-奎寧環(huán)醇：Nakazaewaea、假絲酵母屬（Candida)、 變形菌屬（Proteus)、紅酵母屬（Rhodotorula)、Sporidiolobus、紅冬抱酵母屬 (Rhodosporidium)、裂殖酵母（Schizosaccharomyces)、隱球酵母屬（Cryptococcus)、 絲孢酵母屬（Trichisporon)、戈登氏菌屬（Gordonia)、諾卡菌屬（Nocardia)、產(chǎn)堿桿菌 屬（Alcaligenes)、棒狀桿菌屬（Corynebacterium)、節(jié)桿菌屬（Arthrobacter)、線黑粉 酵母屬（Filobasisdium)、短梗霉屬（Aureobasidium)、耶羅維亞酵母屬（Yarrowia)、 地霉屬（Geotrichum)、家村氏菌屬（Tsukamurella)、庫特氏菌屬（Kurthia)、微桿菌屬 (Microbacterium)、克魯維酵母屬（Kluyveromyces)、枝頂抱霉屬（Acremonium)和毛霉屬 (Mucor)(參考JP10243795、JP11196890、JP2002153293、JP2000245495)。因微生物細(xì)胞招 致的和或微生物中所含的其他酶引起的副反應(yīng)招致的雜質(zhì)降低光學(xué)純度和產(chǎn)物產(chǎn)率。
[0009] 使用分離的酶通過氧化還原過程制備（R)-3-奎寧環(huán)醇也是本領(lǐng)域已知的并且 已經(jīng)對來自曼陀羅屬（Datura)和天仙子屬（Hyoscyamus)(專利JP2003230398)植物的 酶以及來自紅酵母屬（Rhodotorula) (JP2007124922)、伯克霍爾德菌屬（Burkholderia) (W02010123062)和微黃微桿菌（Microbacterium luteolum) (Int J Mol Sci. 20120ct 19 ; 13 (10): 13542-53)的酶進(jìn)行報道。最近一種還原奎寧環(huán)-3-酮的醇脫氫酶已經(jīng)從根癌農(nóng) 桿菌（Agrobacterium tumerfacience)結(jié)晶（Acta crystallografica 10(2012)68(Pt 10):1237-1239)〇
[0010] 因為源于植物，衍生自曼陀羅屬和天仙子屬的酶難以工業(yè)制造。源自紅酵母屬和 伯克霍爾德菌屬的酶需要昂貴的NADPH作為輔因子并需要葡萄糖脫氫酶用于NADPH再生， 因此造成生產(chǎn)過程非常昂貴。
[0011]迄今，Isotani等人，（IntJMolSci. 20120ct19 ;13 (10) : 13542-53)報道了使 用來自微黃微桿菌的酶的還原過程產(chǎn)生（R)-3-奎寧環(huán)醇的最高效方法。衍生自微黃微桿 菌的酶需要NADH作為輔因子并需要仲醇脫氫酶用于輔因子再生，連同需要2-丙醇作為共 底物。然而，在這種酶促還原過程中，底物載量有限，這推測地歸因于奎寧環(huán)-3-酮對酶活 性的抑制作用。可以通過以下方式實現(xiàn)最大底物載量10% (w/v):向反應(yīng)混合物連續(xù)添加 底物，因此維持反應(yīng)容器中的奎寧環(huán)-3-酮濃度并同時以足夠水平抑制酶。使用固定酶，在 15% (w/v)底物載量實現(xiàn)100%轉(zhuǎn)化產(chǎn)率。但是，酶的固定費力且昂貴，并對反應(yīng)體積造成 限制，這與工業(yè)生產(chǎn)過程的要求不相稱。
[0012] 還原奎寧環(huán)-3-酮的已知酶數(shù)目有限。另外，這些酶并未市售并且相應(yīng)的還原過 程具有重大缺陷。因此，需要用還原反應(yīng)中作為生物催化劑使用的新重組氧化還原酶產(chǎn)生 (R) -3-奎寧環(huán)醇的高效和工業(yè)可應(yīng)用的方法。
[0013] 適于3-奎寧環(huán)酮工業(yè)還原方法的氧化還原酶必須滿足以下要求：
[0014] 1)在重組菌株中（例如在大腸桿菌（Escherichiacoli)中）相應(yīng)表達(dá)；
[0015] 2)在有機溶劑、尤其在水可溶混性有機溶劑如2-丙醇和2- 丁醇中穩(wěn)定性高；
[0016] 3)在底物3-奎寧環(huán)酮高濃度時有酶活性，沒有不利地受底物或產(chǎn)物抑制作用影 響；
[0017] 4)與酶偶聯(lián)的輔因子再生、尤其與使用仲醇作為共底物借助醇脫氫酶的輔因子再 生相容。
[0018] 本發(fā)明的目的是提供一種通過使用輔因子和分離的氧化還原酶、表達(dá)所述氧化還 原酶的重組生物、或表達(dá)所述氧化還原酶的生物的制品（如其透化、裂解或凍干細(xì)胞）還原 奎寧環(huán)-3-酮或其鹽，制備（R)-3-奎寧環(huán)醇的方法。該氧化還原酶選自
[0019]a)多肽，其具有序列表的氨基酸序列SEQIDNO: 1或SEQIDN0:3或SEQIDN0:5 或SEQIDN0:7 或SEQIDN0:9 ;或
[0020]b)多肽，其具有通過置換、缺失或添加1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39至40 個或更多個氨基酸殘基從3￡〇10勵：1或3￡〇10勵:3或3￡〇10勵:5或3￡〇10勵:7或 SEQIDN0:9衍生的氨基酸序列，并能夠與輔因子聯(lián)合還原奎寧環(huán)-3-酮；或
[0021] c)多肽，其具有下述氨基酸序列，其中至少51%的氨基酸與SEQIDN0:1或SEQID NO:3或SEQIDNO:5或SEQIDNO:9的氨基酸相同、優(yōu)選地其中至少55%的氨基酸與SEQ IDN0:1或SEQIDN0:3或SEQIDN0:5或SEQIDN0:9的氨基酸相同、或其中至少60% 的氨基酸與3￡〇10勵：1或5￡〇10勵:3或5￡〇10勵:5或5￡〇10勵:9的氨基酸相同、 或其中至少65%的氨基酸與SEQIDNO:l或SEQIDNO:3或SEQIDNO:5或SEQIDNO:9 的氨基酸相同、或其中至少70%的氨基酸與SEQIDNO: 1或SEQIDNO:3或SEQIDNO:5 或SEQIDN0:9的氨基酸相同、或優(yōu)選地其中至少75%的氨基酸與SEQIDN0:1或SEQID N0:3或SEQIDN0:5或SEQIDN0:9的氨基酸相同、更優(yōu)選地其中至少85%的氨基酸與 3￡〇10勵：1或3￡〇10勵 :3或3￡〇10勵:5或3￡〇10勵:9的氨基酸相同、最優(yōu)選地其中 至少90%的氨基酸與5￡〇10勵：1或5￡〇10勵:3或5￡〇10勵:5或5￡〇10勵:9的氨基 酸相同，并且能夠與輔因子一起還原奎寧環(huán)-3-酮；或
[0022] d)多肽，其具有下述氨基酸序列，其中至少65%、優(yōu)選地至少70%或至少75%或 至少80 %、更優(yōu)選地至少85 %、最優(yōu)選地至少90 %的氨基酸與SEQIDN0:7的氨基酸相同， 并且能夠與輔因子一起還原奎寧環(huán)-3-酮；或
[0023]e)多肽，其由具有序列表的核苷酸序列SEQIDN0:2或SEQIDN0:4或SEQID NO:6或SEQIDNO:8或SEQIDNO: 10的多核苷酸編碼；或
[0024]f)多肽，所述多肽由具有下述核苷酸序列的多核苷酸編碼，所述核苷酸序列在嚴(yán) 格條件下與核苷酸序列3￡〇10勵:2或3￡〇10勵:4或3￡〇10勵:6或3￡〇10勵:8或 SEQIDN0:10的全長互補序列雜交，并且能夠與輔因子一起還原奎寧環(huán)-3-酮；或
[0025]g)根據(jù)a)或b)或c)或d)或e)或f)的多肽，所述多肽還包含氨基酸序列基序 MQXiREXAWEA，其中Xi、X2、X3每一者是以下氨基酸殘基的任一者：A(Ala)、R(Arg)、N(Asn)、 D(Asp)、C(Cys)、Q(Gln)、E(Glu)、G(Gly)、H(His)、I(Ile)、L(Leu)、K(Lys)、M(Met)、F(Phe)、 P(Pro)、S(Ser)、T(Thr)、W(Trp)、Y(Tyr)或V(Val)。
[0026] 優(yōu)選地，氧化還原酶與輔因子NADH或NADPH聯(lián)合使用。
[0027] 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)根據(jù)a)或b)或c)或d)或e)或f)或g)的本發(fā)明多肽能夠?qū)⒖鼘?環(huán)-3-酮高效還原成其相應(yīng)的（R)_醇。令人驚訝地，本發(fā)明多肽之間的序列同源性（同一 性）（參見表1)從48%變動至72%。然而，本發(fā)明的多肽具有共同的特定氨基酸序列基序 MQXiREXJWEA，所述基序是這些蛋白質(zhì)的酶活性在還原奎寧環(huán)-3-酮中特有的。
[0028]
L0029」序列.序MW^KeWWEA位t蛍日質(zhì)的C禾爾附進(jìn)。這一友現(xiàn)與匕知羝鏈醉貺氨_ 的晶體結(jié)構(gòu)和基于其的同源性建模相匹配，這揭示這個基序形成該脫氫酶的底物結(jié)合口袋 的尾部，其中氨基殘基1〇、1?4^和4與底物相互作用。因此推定包含基序1?乂11?乂2乂 3￥￡八 的短鏈醇脫氫酶適于還原奎寧環(huán)-3-酮。
[0030] 適于還原奎寧環(huán)-3-酮、優(yōu)選地還原成相應(yīng)R-醇的氧化還原酶理解為這樣的多 肽，所述多肽在優(yōu)化的反應(yīng)條件下產(chǎn)生至少50%對映異構(gòu)過量的R-醇。本文中，優(yōu)化的反 應(yīng)條件理解為多肽產(chǎn)生最大對映異構(gòu)過量的R-醇的反應(yīng)條件。
[0031] 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的多肽提供足夠的氧化還原酶活性并且可以用于還原奎寧 環(huán)-3-酮，優(yōu)選地還原成（R)-3-奎寧環(huán)醇?？蓪崿F(xiàn)的對映異構(gòu)過量的R-醇總計大于或等 于50%、優(yōu)選地大于或等于80%和特別優(yōu)選地大于或等于95%。當(dāng)使用SEQIDNO: 1時， 可以實現(xiàn)大于或等于99%的對映異構(gòu)過量。
[0032] 能夠?qū)⒖鼘幁h(huán)-3-酮還原成相應(yīng)（R)-3-奎寧環(huán)醇的氧化還原酶可以從分枝桿 菌屬