細(xì)菌、尤其從范巴倫氏分枝桿菌或從恥垢分枝桿菌、從Caldilinea屬細(xì)菌、尤其從 Caldi1ineaaerophila、從Starkeya屬細(xì)菌、尤其從Starkeyanovella、從大洋嗜熱桿菌屬 (Oceanithermus)細(xì)菌、尤其從熱液口大洋嗜熱桿菌分離。
[0033] 通過(guò)使用已知分子生物技術(shù)，例如從細(xì)菌范巴倫氏分枝桿菌菌株P(guān)YR-1或恥 垢分枝桿菌菌株ATCC700084的基因組DNA、從Caldilinea屬細(xì)菌、尤其從Caldilinea aerophila菌株DSM14535、從Starkeya屬細(xì)菌、尤其從StarkeyanovellaDSM506、從大洋 嗜熱桿菌屬細(xì)菌、尤其從熱液口大洋嗜熱桿菌可獲得編碼本發(fā)明氧化還原酶的多核苷酸。
[0034] 產(chǎn)生該氧化還原酶的生物優(yōu)選地是過(guò)量表達(dá)該氧化還原酶的重組生物。這類(lèi)重組 生物優(yōu)選地是，但是不限于，大腸桿菌。重組生物表達(dá)的氧化還原酶可以按完全純化的狀 態(tài)、按部分純化的狀態(tài)或作為含有該多肽的細(xì)胞使用。表達(dá)該多肽的細(xì)胞可以在天然、透 化、裂解或凍干狀態(tài)下使用。
[0035] 因此，本發(fā)明的另一個(gè)方面是該氧化還原酶、產(chǎn)生這種氧化還原酶的生物或表達(dá) 所述氧化還原酶的生物的制品，如其透化、裂解或凍干細(xì)胞，所述氧化還原酶能夠使用輔因 子，將奎寧環(huán)-3-酮對(duì)映選擇性還原成其相應(yīng)的醇。這種氧化還原酶選自
[0036]a)多肽，其具有序列表的SEQIDN0:1 或SEQIDN0:3 或SEQIDN0:5 或SEQID NO:7或SEQIDNO:9氨基酸序列；或
[0037] b)多肽，其具有通過(guò)置換、缺失或添加 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39 至 40 個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基從3￡〇10勵(lì)：1或3￡〇10勵(lì):3或3￡〇10勵(lì):5或3￡〇10勵(lì):7或 SEQIDN0:9 衍生；或
[0038]c)多肽，其具有其中至少51 %的氨基酸與SEQIDNO: 1或SEQIDN0:3的氨基酸 相同的氨基酸序列；或
[0039]d)多肽，其具有其中至少55%的氨基酸與SEQIDN0:5或SEQIDN0:9的氨基酸 相同的氨基酸序列；或
[0040]e)多肽，其具有其中至少70 %的氨基酸與SEQIDN0:7的氨基酸相同的氨基酸序 列；或
[0041]f)多肽，其由具有序列表的核苷酸序列SEQIDN0:2或SEQIDN0:4或SEQID NO:6或SEQIDNO:8或SEQIDNO: 10的多核苷酸編碼；或
[0042]g)多肽，所述多肽由具有下述核苷酸序列的多核苷酸編碼，所述核苷酸序列在嚴(yán) 格條件下與具有核苷酸序列SEQIDN0:2或SEQIDN0:4或SEQIDN0:6或SEQIDN0:8 或SEQIDNO: 10的多核苷酸的全長(zhǎng)互補(bǔ)序列雜交；或
[0043]h)根據(jù)a)或b)或c)或d)或e)或f)的多肽，所述多肽還包含氨基酸序列基序 MQXiREXAWEA，其中Xi、X2、X3每一者是以下氨基酸殘基的任一者：A(Ala)、R(Arg)、N(Asn)、 D(Asp)、C(Cys)、Q(Gln)、E(Glu)、G(Gly)、H(His)、I(Ile)、L(Leu)、K(Lys)、M(Met)、F(Phe)、 P(Pro)、S(Ser)、T(Thr)、W(Trp)、Y(Tyr)或V(Val)。
[0044] 優(yōu)選地，氧化還原酶與輔因子NADH或NADPH聯(lián)合使用。
[0045]在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"氨基酸序列（A)，其中（P) %百分?jǐn)?shù)的氨基酸與氨基酸序列SEQ IDNO: (N)的氨基酸相同"指氨基酸序列㈧和SEQIDNO: (N)在它們的全長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)齊 并且其中對(duì)齊的氨基酸序列（A)和對(duì)齊的SEQIDNO: (N)的任一者可以相對(duì)其相應(yīng)的未對(duì) 齊序列包含空位插入。通過(guò)以下方式計(jì)算同一性百分?jǐn)?shù)：確定相同氨基酸殘基在對(duì)齊的氨 基酸序列（A)和對(duì)齊的SEQIDN0:N中均出現(xiàn)的位置的數(shù)目并將匹配位置的數(shù)除以參考序 列中的殘基總數(shù)。結(jié)果乘以100,產(chǎn)生同一性百分?jǐn)?shù)。可以通過(guò)使用BLAST和BLAST2.0 算法實(shí)施序列的比對(duì)，所述算法在Altschul等人，1977,NucleicAcidsRes. 3389-3402和 Altschul等人，1990,J.Mol.Biol. 215:403-410 中描述。
[0046] 在本發(fā)明中，根據(jù)b)或c)或d)或f)或g)的多肽，即具有下述氨基酸序列的人 工或天然存在多肽，是相對(duì)于SEQIDN0:1或SEQIDN0:3或SEQIDN0:5或SEQIDN0:7 或SEQIDN0:9包含"缺失的氨基酸"（缺失）、"置換的氨基酸"（置換）或"插入的氨基 酸"（插入）的多肽，其中所述氨基酸序列同源于或衍生自氨基酸序列SEQIDN0:1或SEQ IDN0:3或SEQIDN0:5或SEQIDN0:7或SEQIDN0:9;或由具有下述核苷酸序列的多核 苷酸編碼，所述核苷酸序列在嚴(yán)格條件下與SEQIDN0:2或SEQIDN0:4或SEQIDN0:6 或SEQIDN0:8或SEQIDNO: 10的全長(zhǎng)互補(bǔ)序列雜交。
[0047] 術(shù)語(yǔ)"缺失的氨基酸"或"缺失"指通過(guò)移除一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾多肽。缺失可 以包括移除SEQIDN0:1 或SEQIDN0:3 或SEQIDN0:5 或SEQIDN0:7 或SEQIDN0:9 的內(nèi)部部分和 / 或末端部分中 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40 個(gè)或更多個(gè)氨基酸、 直至其中氨基酸總數(shù)的10%、同時(shí)保留酶活性。
[0048] 術(shù)語(yǔ)"插入"指通過(guò)添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾多肽。插入可以包括在SEQID NO: 1 或SEQIDNO: 3 或SEQIDNO: 5 或SEQIDNO: 7 或SEQIDNO:9 的內(nèi)部部分和 / 或末 端部分中的多個(gè)位置向多肽添加 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40 個(gè)或更多個(gè)氨基 酸。
[0049]置換涉及置換SEQIDN0:1 或SEQIDN0:3或SEQIDN0:5或SEQIDN0:7或SEQ IDN0:9 中的 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、 26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40個(gè)或更多個(gè)氨基酸，并且可以是保守的 和/或非保守的。保守性氨基酸置換涉及將氨基酸殘基更換為具有相似側(cè)鏈或?qū)儆谙嗤?基酸類(lèi)別的氣基酸殘基，例如從未水性殘基換成未水性殘基、從疏水性殘基換成疏水性殘 基、從非極性殘基換成非極性殘基、極性殘基換成極性殘基、酸性殘基換成酸性殘基、堿性 殘基換成堿性殘基、芳族殘基換成芳族。下表中描述保守性置換的例子：
[0050]
[0051] 非保守性置換指將多肽中某氨基酸更換為具有顯著差異側(cè)鏈和/或物理化學(xué)特 性的氨基酸。非保守性氨基酸置換可能影響多肽的結(jié)構(gòu)、其疏水性和/或凈電荷。
[0052] 因此，本發(fā)明還涉及具有此后所述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列在位置 1-282的每個(gè)位置處包含選自方括號(hào)所包含的相應(yīng)選擇群組中的一個(gè)氨基酸，其中指 空位：
[0053]
[0054]
[0055]
[0056]
[0057]
[0058]
[0059]
[0060]
[0061]
[0062]
[0063] 該多肽序列中氨基酸修飾的數(shù)目可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40 個(gè)或更多個(gè)氨基酸，直至總數(shù)氨基酸的10%、或20%或甚至30%，同時(shí)保留或改善多肽的 催化活性。
[0064] 在嚴(yán)格條件下與例如具有核苷酸序列SEQIDN0:2的多核苷酸的全長(zhǎng)互補(bǔ)序列 雜交的多核苷酸包括通過(guò)使用SEQIDN0:2互補(bǔ)全長(zhǎng)DNA作為雜交探針，通過(guò)多樣雜交技 術(shù)如菌落雜交、噬菌斑雜交、DNA印跡雜交可檢測(cè)的多核苷酸。合適雜交方法在Molecular Cloning,Alaboratorymanual,第 2 版（ColdSpringHarborLaboratoryPress, 1989) 中描述。
[0065] 對(duì)于雜交，將所研究的多核苷酸固定在濾膜上并在60°C在0. 7-1M NaCl溶液中與 例如SEQ ID N0:2的多核苷酸互補(bǔ)序列雜交，隨后，將濾膜在65°C用0. 1至2倍SSC溶液洗 滌，其中1倍SSC溶液理解是由150mM NaCl和15mM檸檬酸鈉組成的混合物。
[0066] 在嚴(yán)格條件下例如與SEQ ID N0:2的互補(bǔ)序列雜交的多核苷酸具有其中至少65% 優(yōu)選地至少70%的核苷酸與SEQ ID N0:2的核苷酸相同的核苷酸序列。
[0067] 本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案特征是：在仲醇存在下，通過(guò)氧化還原酶的作用連續(xù)地再 生本方法中所用的輔因子。優(yōu)選地，使用NADH作為輔因子，其中，還原中形成的NAD還原回NADH。
[0068] 可以將氧化還原酶對(duì)NADH的輔因子偏好性改變成偏好NADPH并通過(guò)使用誘變技 術(shù)，通過(guò)突變輔因子結(jié)合位點(diǎn)予以逆轉(zhuǎn)。
[0069] 在本發(fā)明的方法中，優(yōu)選地連續(xù)再生由氧化還原酶/脫氫酶形成的氧化型輔因子 麵或熟DP〇
[0070] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，通過(guò)醇的氧化，再生氧化型輔因子NAD或NADP。
[0071] 優(yōu)選地，通式RxRyCH0H仲醇用于輔因子再生，其中I^PRy獨(dú)立選自氫、分枝或不分 枝的Q-Qr烷基，其中碳原子總數(shù)C,&SJ>=3。
[0072] 優(yōu)選地使用仲醇如2-丙醇、2- 丁醇、2-戊醇、3-戊醇、4-甲基-2-戊醇、2-庚醇、 2_辛醇或環(huán)己醇作為共底物。根據(jù)特別優(yōu)選的實(shí)施方案，2-丙醇或4-甲基-2-戊醇用于 輔酶再生?；诜磻?yīng)混合物的總體積，用于再生的共底物的量可以在水可溶混性仲醇情況 下，是以體積計(jì)5 %至70 %、優(yōu)選地5 %至50 %、更優(yōu)選5 %至40 %、最優(yōu)選地以體積計(jì)5 % 至20%，而在水不溶混性仲醇如甲基-2-戊醇情況下，優(yōu)選的濃度是5%至80%、更優(yōu)選地 20%至80%、最優(yōu)選地40%至80%。
[0073] 根據(jù)本發(fā)明方法的又一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，添加額外的氧化還原酶/脫氫酶以再生 輔因子。
[0074] 在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以，額外地添加又一種醇脫氫酶以再生輔