一種脫甲基t-2毒素及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種新的隱蔽態(tài)毒素，特別是一種脫甲基Τ-2毒素。本發(fā)明還涉及該 毒素的制備方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] Τ-2毒素是鐮孢菌（/feiari? spp)產(chǎn)生的倍半萜烯類真菌毒素，結(jié)構(gòu)如下所示：
[0003] 歷史上出現(xiàn)的T-2毒素引起的疾病的大暴發(fā)，主要都是由于攝入了含有過量的 T-2毒素及其有毒代謝產(chǎn)物的食物引起的。動物及人類在一定范圍內(nèi)攝入T-2毒素后會通 過自身的解毒機制來進行代謝，主要是體內(nèi)的I相和II相生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)代謝。T-2毒素的 代謝主要有單個基本反應(yīng)，包括水解(酯基)、氧化（T-2毒素C-3脂肪族羥基化）和還原(單 端孢霉烯12, 13-環(huán)氧環(huán))，以及結(jié)合反應(yīng)(葡萄糖苷酸化等)。
[0004] 不同的動植物代謝T-2毒素產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物也各有差異，現(xiàn)在已知的代謝產(chǎn)物主 要包括HT-2 toxin，NEO toxin，3' -OH-T-2, de-印oxy-HT-2等二十幾種產(chǎn)物。每種產(chǎn)物 的毒性也有很大差異，C12與C13間環(huán)氧環(huán)是A型單端孢霉烯族毒素的必需毒性基團，在大 鼠皮膚刺激實驗中，脫環(huán)氧T-2毒素毒性是T-2毒素毒性的1/400。強毒性A型單端孢霉烯 族毒素都含有環(huán)氧基團，當(dāng)環(huán)氧環(huán)被打開后，毒素的毒性作用基本消失。
[0005] 有些代謝產(chǎn)物，例如哺乳動物代謝T-2毒素后的II相代謝產(chǎn)物T-2-GluA和 HT-2-GluA用檢測T-2毒素的常規(guī)方法很難檢測到，這類真菌毒素被稱為隱蔽態(tài)真菌毒素。 由于真菌毒素與生物大分子結(jié)合導(dǎo)致極性、溶解性及分子量發(fā)生變化，很難用常規(guī)的方法 檢測到。但這類隱蔽態(tài)的真菌毒素在某些條件下能水解為真菌毒素原型，從而保持了其原 有毒性，隱蔽態(tài)真菌毒素是一種潛在的食品危害。目前制約隱蔽態(tài)真菌毒素檢測的主要原 因是缺之隱蔽態(tài)真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品。
[0006] 現(xiàn)在已知的隱蔽態(tài)真菌毒素合成方法中，化學(xué)法一般是運用Koenigs-Knor反應(yīng)， 用這種方法Grabley等和Zill等合成了 ZEN結(jié)合物。對Koenigs-Knor反應(yīng)稍加修改合成 了 D0N-3G和D0N-15G。雖然化學(xué)法能夠大量生產(chǎn)隱蔽態(tài)真菌毒素，但是試劑昂貴，并且不適 用于所有真菌毒素，隱蔽態(tài)T-2毒素的合成就不適合用化學(xué)法，因為這個反應(yīng)最后一步需 要脫去乙?；@容易使T-2毒素上的乙?；裁撊?，所以該法不適用于合成T-2-GluA。還 有一種方法是通過發(fā)酵過程產(chǎn)生ZEN-14-Glu，運用Saccharomyces cerevisiae基因工程 菌株來表UDPGT。另一種方法就是利用動物體內(nèi)的UDPGT酶來合成糖苷酸化合物，有報道用 酶法合成了 ZEN及其五種代謝物的糖苷酸結(jié)合物，采用大鼠和人的肝微粒體中的UDPGT合 成了 DON-8-GluA和DON-15-GluA，采用小鼠、大鼠、人、豬肝微粒體酶法合成了 T-2毒素和 HT-2毒素的葡萄糖苷酸化合物。不管使用哪一種方法，隱蔽態(tài)毒素標(biāo)準(zhǔn)品的合成成本均較 高，也較為耗時。
[0007] 很多藥物的代謝都要通過肝臟，在肝臟中進行I相和II相反應(yīng)，I相反應(yīng)主要包 括氧化、脫甲基化和水解反應(yīng)。一些化合物經(jīng)過I相的反應(yīng)后，非極性的脂溶性化合物變成 機性和水溶性較高的代謝物。脫甲基反應(yīng)一般是P450酶的作用產(chǎn)生，而且一般只產(chǎn)生在 0-甲基位和N-甲基位；一些金屬也會發(fā)生脫甲基化反應(yīng)，但是一般都是有微生物參與的， 是由于微生物介導(dǎo)的電子傳遞，使甲基去除。例如：Hg的甲基化是在SRB硫酸鹽還原菌，IB 鐵細菌等參與下實現(xiàn)的，通常維生素B等可以提供微生物的碳源；有機化合物的脫甲基反 應(yīng)在化工工業(yè)中也較常用，例如：在催化氫化的條件下，甲苯和二甲苯都可以脫去甲基生成 苯，甲基萘也可以脫去甲基生成萘，這都是制備苯和萘的工業(yè)方法。然而，之前的文獻報道 的T-2代謝產(chǎn)物中未發(fā)現(xiàn)有脫甲基T-2毒素，T-2毒素在化學(xué)反應(yīng)下能發(fā)生脫甲基反應(yīng)也 未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)并制備了脫甲基T-2毒素，為食品安全性提供了一種新的檢測方 法，該方法簡單方便且成本大幅度降低。
[0009] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是： 一種脫甲基T-2毒素，其結(jié)構(gòu)為：
[0010] 脫甲基T-2毒素是發(fā)明人在實驗過程中的意外發(fā)現(xiàn)，之前的文獻均沒有報道T-2 代謝產(chǎn)物中存在脫甲基T-2毒素。發(fā)明人在T-2毒素的代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了脫甲基T-2毒素。 脫去了甲基的脫甲基T-2毒素仍然保留T-2毒素的毒性基團，毒性和T-2毒素差不多，但是 其制備和檢測均方便容易得多。
[0011] 優(yōu)選地，脫甲基T-2毒素由T-2毒素在Tris-HCl緩沖液中脫甲基而制成。反應(yīng)式 如下所示：
[0012] 本發(fā)明還提供一種脫甲基T-2毒素的制備方法，包括：往T-2毒素中加入 Tri s-HCl緩沖液，保溫一段時間。該方法轉(zhuǎn)化率高、產(chǎn)量大、純度高、成本低，不需要大型儀 器和特殊培訓(xùn)的專業(yè)操作人員，樣品不需要特殊前處理，可以作為脫甲基T-2毒素標(biāo)準(zhǔn)品 大量生產(chǎn)。
[0013] 優(yōu)選地，Tris-HCl緩沖液的濃度為20~100mM，pH為L 1~9· 0, Tris-HCl緩沖液與 T-2毒素的比例為（6~10)yL:(l~5) yg，優(yōu)選8 yL: 3 yg。優(yōu)選地，Tris-HCl緩沖液液 中包含有18(：12;進一步優(yōu)選地，Tris-HCl緩沖液中含有5mM MgCl 2。
[0014] 優(yōu)選地，T-2毒素與Tris-HCl緩沖液的反應(yīng)溫度是20~50 °C，反應(yīng)時間是 50~150min。優(yōu)選地，往T-2毒素中加入Tris-HCl緩沖液，于37°C水浴保溫90min。
[0015] 優(yōu)選地，該方法還包括步驟：加入三氯甲烷，離心，取三氯甲烷層，氮氣吹干。
[0016] 進一步優(yōu)選地，離心是在16000g下離心10min。進一步優(yōu)選地，氮氣吹干后，放 入-20 °C冰箱凍存。
[0017] 本發(fā)明還提供使用本發(fā)明的制備方法制成的脫甲基T-2毒素標(biāo)準(zhǔn)品。在經(jīng)歷上述 制備方法的步驟之后，得到的脫甲基T-2毒素進一步純化后可以作為標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)用。所述純 化可采用本領(lǐng)域所熟知的那些技術(shù)。
[0018] 本發(fā)明還公開了脫甲基T-2毒素用于食品安全性檢測的用途。具體而言，可制備 脫甲基T-2毒素的標(biāo)準(zhǔn)品，用于檢測食品(例如水產(chǎn)品沖是否存在脫甲基T-2毒素，以及脫 甲基T-2毒素的含量，從而監(jiān)測食品安全性。
[0019] 本發(fā)明還提供一種脫甲基T-2毒素的檢測方法，包括：取試驗樣品，用含有乙醇胺 的甲醇水溶解樣品，震蕩均勻后過濾，用脫甲基T-2毒素作為標(biāo)準(zhǔn)品，以LC-MS/MS全掃描模 式對樣品進行掃描。所述試驗樣品為待檢測樣品，例如水產(chǎn)食品樣品。
[0020] 優(yōu)選地，取吹干的試驗樣品，用重量比3:7~3:10的甲醇水溶解，其中所述甲醇水 含有0. 05%~0. 15%重量體積比的乙醇銨，然后渦旋震蕩5~15min，并過0. 22~0. 25 μ 1的濾 膜，以LC-MS/MS全掃描模式對樣品進行掃描，將得到的圖譜與標(biāo)準(zhǔn)品的圖譜進行比較。
[0021] 本發(fā)明的有益效果是： 本發(fā)明提供的脫甲基T-2毒素是首次發(fā)現(xiàn)的T-2毒素的代謝產(chǎn)物。該毒素是一種隱蔽 態(tài)毒素，仍保留T-2-毒素的毒性基團，毒性與T-2毒素相當(dāng)。因而，當(dāng)其存在于食品中時， 如果檢測不出這種隱蔽態(tài)毒素，會導(dǎo)致嚴重的食品安全性問題。本發(fā)明提供了脫甲基T-2 毒素及其標(biāo)準(zhǔn)品，能夠檢測食品中是否存在脫甲基T-2毒素這種隱蔽態(tài)毒素，從而確保食 品的安全性。
[0022] 現(xiàn)有技術(shù)中，一般通過檢測T-2毒素及其代謝產(chǎn)物來作為監(jiān)測食品安全性的指標(biāo) 之一。但是，T-2毒素相關(guān)的隱蔽態(tài)毒素的檢測目前受到制約，主要原因是缺乏隱蔽態(tài)真菌 毒素標(biāo)準(zhǔn)品；同時，標(biāo)準(zhǔn)品合成成本較高，較為耗時。而本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了新的T-2毒素代謝產(chǎn) 物一一脫甲基T-2毒素，為食品安全性檢測提供了一種新的途徑。并且，脫甲基T-2毒素的 制備方法簡單，一步合成，相對于傳統(tǒng)的T-2毒素相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)品，節(jié)省大量步驟、試劑和時間。 并且脫甲基T-2毒素能大量合成，從而能夠十分容易地制備出充足的標(biāo)準(zhǔn)品，供檢測之用， 大幅降低了標(biāo)準(zhǔn)品合成的成本以及檢測成本。與使用現(xiàn)有的T-2毒素相關(guān)的隱蔽態(tài)毒素進 行檢測相比，使用脫甲基T-2毒素標(biāo)準(zhǔn)品進行檢測，方法簡單方便，成本大幅減低，具有意 想不到的效果。
[0023] 脫甲基T-2毒素是一種還未見報道的新物質(zhì)，它是以T-2毒素作為前體，放入 Tris-HCl緩沖液中發(fā)生脫甲基反應(yīng)，進一