步純化后可獲得高純度的脫甲基T-2毒素，純度 可達(dá)70%或以上。該方法主要包括脫甲基T-2毒素體外合成反應(yīng)技術(shù)、脫甲基T-2毒素的 LC-MS/MS定量檢測(cè)，該方法轉(zhuǎn)化率高(轉(zhuǎn)化率能達(dá)到70%以上)、產(chǎn)量大、純度高、成本低，與 現(xiàn)有的T-2毒素及其代謝產(chǎn)物不同，其不需要大型儀器和特殊培訓(xùn)的專業(yè)操作人員，樣品 不需要特殊前處理，可以作為脫甲基T-2毒素標(biāo)準(zhǔn)品直接生產(chǎn)。
【附圖說(shuō)明】
[0024] 圖1是LC-MS/MS檢測(cè)脫甲基T-2毒素的圖譜； 圖2是LC-MS/MS檢測(cè)脫甲基T-2毒素的總離子流圖； 圖3是脫甲基T-2毒素的二級(jí)質(zhì)譜圖； 圖4是顯示T-2毒素脫甲基的部位的圖； 圖5是脫甲基T-2毒素在小鼠和對(duì)蝦肝微粒體中含量隨時(shí)間變化圖； 圖6是實(shí)施例5糧谷類(lèi)產(chǎn)品中脫甲基T-2毒素的檢測(cè)結(jié)果圖； 圖7是實(shí)施例5糧谷類(lèi)產(chǎn)品中脫甲基T-2毒素的檢測(cè)結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 本研究首次合成出脫甲基的T-2毒素，首次發(fā)現(xiàn)T-2毒素在Tris-Hcl緩沖液中能 發(fā)生脫去甲基的現(xiàn)象；采用LC-MS/MS檢測(cè)脫甲基T-2毒素，并建立了標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0026] 實(shí)施例1.脫甲基T-2毒素的合成 (1)配制 Tris-HCl 緩沖液（25mM，含 5mM MgCl2)，0. lmol/L HCl 調(diào)節(jié) ρΗ7· 4,加超純水 H2O定溶于250mL。（0. lmol/L HCl :取濃鹽酸0. 84mL，超純水H2O定溶于100mL)。
[0027] (2)取溶有T-2毒素的乙腈溶液，氮?dú)獯蹈珊蟮玫絋-2毒素3(^g，加入Tris-HCl 緩沖液25〇μL，37°C水浴孵育90min，后加入三氯甲烷50〇μL，16000g離心10min，后用氮?dú)獯?干，放入-20°C冰箱凍存。
[0028] 實(shí)施例2.脫甲基T-2毒素的檢測(cè) 采用LC-MS/MS定量檢測(cè)：上機(jī)前將實(shí)施例1所得的樣品用50〇μL的甲醇水（甲醇冰 =3:7，重量比）溶解，其中甲醇水中含有0.1%(?八）的乙酸銨，然后漩渦震蕩1〇11^11，并過(guò) 0. 22 的濾膜。以LC-MS/MS全掃描模式（full scan)來(lái)對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。
[0029] 結(jié)果如圖1所示，脫甲基T-2毒素的保留時(shí)間為5.61min。T-2毒素的分子量是 466,脫去甲基后的分子量是452,根據(jù)計(jì)算[脫甲基T-2 +NH4]+的分子量是470,與圖2中最 強(qiáng)峰的分子量一致，這是用T-2毒素與Tris-HCl緩沖液反應(yīng)產(chǎn)生的產(chǎn)物。如圖2所示的脫 甲基T-2毒素總離子流圖（total ion current)，是對(duì)處于的某一質(zhì)量范圍的離子吸收強(qiáng)度 進(jìn)行疊加而得到。
[0030] 圖3是脫甲基T-2毒素的二級(jí)質(zhì)譜圖。從圖3上可以看到T-2毒素的特征離子碎片 峰185, 205, 215, 245, 305, 365,453。因此，可以判定是T-2毒素的產(chǎn)物，只是相差一個(gè)甲基， 如圖2所示，在C-8位側(cè)鏈的基團(tuán)上差一個(gè)甲基（圖4 )，證明此位置的甲基容易在Tri s-HCl 緩沖液中脫掉。
[0031] 另外，從圖1中還可以看出，圖中保留時(shí)間是5. 93min的峰是T-2毒素的峰，峰面 積是142682,而較高的峰是脫甲基T-2毒素的峰，保留時(shí)間是5. 65min，峰面積是1393273， 通過(guò)脫甲基T-2毒素和反應(yīng)剩余T-2毒素的峰面積的比對(duì)大概可以看出脫甲基T-2毒素的 轉(zhuǎn)化率為90%。
[0032] 實(shí)施例3.制備脫甲基T-2毒素標(biāo)準(zhǔn)品 采用與實(shí)施例1相同的方法制備脫甲基T-2毒素，然后經(jīng)親和純化，制得標(biāo)準(zhǔn)品lmg，經(jīng) 檢測(cè)，純度為90%。
[0033] 實(shí)施例4.脫甲基T-2毒素的體外孵育試驗(yàn) 將脫甲基T-2毒素與對(duì)蝦（ShrimpLM)、小鼠（MouLM)肝微粒體進(jìn)行體外孵育，在不同時(shí) 間點(diǎn)通過(guò)LC-MS/MS檢測(cè)（與實(shí)施例2所采用方法相同）計(jì)算峰面積，將所得結(jié)果繪制成圖， 結(jié)果如圖5所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在此過(guò)程中，脫甲基T-2毒素的含量隨著時(shí)間的增加而逐漸減 少。這可能就是小鼠、對(duì)蝦中肝微粒體中的代謝酶對(duì)其進(jìn)行代謝的結(jié)果。由于脫甲基T-2 毒素依然保留有環(huán)氧化、雙鍵等毒性基團(tuán)，毒性與T-2毒素差不多，動(dòng)物或者人食用后仍然 具有毒性作用。
[0034] 實(shí)施例5.污染T-2毒素的糧食中脫甲基T-2毒素的檢測(cè) 為檢測(cè)脫甲基T-2毒素，取真菌毒素或霉變的糧谷類(lèi)產(chǎn)品5g，置于100mL的錐形瓶中， 加入乙腈：水（9:1) 10ml，漩禍震蕩30min，取混合液1500g離心10min。取上清用0. 22 μπι 的濾器過(guò)濾。取濾液用MultiSep228免疫親和小柱凈化。以lmL/min的流速過(guò)柱后，收集 最初的2mL洗脫液。將洗脫液置40°C以溫和的氮?dú)饬鬟M(jìn)行干燥。取殘?jiān)?，用含有IOmM醋酸 銨的甲醇-水（4:6v/v ) ImL溶解。用LC-MS/MS全掃描模式進(jìn)行檢測(cè)，與實(shí)施例3所得標(biāo)準(zhǔn) 品的圖譜進(jìn)行比較，檢測(cè)其中的脫甲基T-2毒素。結(jié)果如圖6、圖7所示。從圖中可定性地 看出糧谷產(chǎn)品中存在脫甲基T-2毒素。
[0035] 進(jìn)一步地，還可通過(guò)計(jì)算峰面積計(jì)算出糧谷產(chǎn)品中的脫甲基T-2毒素含量。例如， 知道T-2毒素的加入量3Pg和剩余含量0. 32Pg，然后根據(jù)剩余T-2毒素檢測(cè)的含量進(jìn)行半 定量，脫甲基T-2毒素的峰面積與T-2毒素峰面積的比值大致為9:1，可以得出脫甲基T-2 毒素大致含量為2. 7Pg左右。
[0036] 實(shí)施例6.脫甲基Τ-2毒素的合成 采用與實(shí)施例1相同的方法制得5批脫甲基Τ-2毒素，但采用的Tris-HCl緩沖液及反 應(yīng)條件如表1所示。
[0037] 表1脫甲基Τ-2毒素的合成條件
以上結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了進(jìn)一步的描述。但是應(yīng)注意的是，所列出的實(shí)施例僅為 舉例，并非對(duì)本發(fā)明的限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員在所描述的實(shí)施例的基礎(chǔ)上所作出的適應(yīng)性 修改和各種變形，均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種脫甲基T-2毒素，其結(jié)構(gòu)為：2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的脫甲基Τ-2毒素，其特征在于：所述脫甲基Τ-2毒素由Τ-2毒 素在Tris-HCl緩沖液中脫甲基而制成。3. -種脫甲基Τ-2毒素的制備方法，其特征在于：往Τ-2毒素中加入Tris-HCl緩沖液， 保溫。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的脫甲基Τ-2毒素的制備方法，其特征在于：所述Tris-HCl緩 沖液的濃度為20~100mM，pH為L(zhǎng) 1~9· 0,包含（3~8)mM MgCl2，T-2毒素與Tris-HCl緩沖液 的比例為：（1~5) μ g : (6~10) μ L。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的脫甲基Τ-2毒素的制備方法，其特征在于：反應(yīng)溫度是 20~50°C，反應(yīng)時(shí)間是 50~150min。6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的脫甲基Τ-2毒素的制備方法，其特征在于：還包括步驟：加入 三氯甲烷，離心，取三氯甲烷層，氮?dú)獯蹈伞?. -種脫甲基Τ-2毒素標(biāo)準(zhǔn)品，其特征在于：采用權(quán)利要求6的制備方法制成脫甲基 Τ-2毒素，然后進(jìn)一步純化。8. 脫甲基Τ-2毒素用于食品安全性檢測(cè)的用途。9. 一種脫甲基Τ-2毒素的檢測(cè)方法，其特征在于：取試驗(yàn)樣品，用含有乙醇胺的甲醇水 溶解，震蕩均勻后過(guò)濾，用脫甲基Τ-2毒素作為標(biāo)準(zhǔn)品，以LC-MS/MS全掃描模式對(duì)樣品進(jìn)行 掃描。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的脫甲基Τ-2毒素的檢測(cè)方法，其特征在于：取吹干的 試驗(yàn)樣品，用重量比3:7~3:10的甲醇水溶解，其中所述甲醇水含有0. 05%~0. 15%重量 體積比的乙醇銨，然后渦旋震蕩5~15min，并過(guò)0. 22~0. 25 μπι的濾膜，以LC-MS/MS全掃描 模式對(duì)樣品進(jìn)行掃描，將得到的圖譜與標(biāo)準(zhǔn)品的圖譜進(jìn)行比較。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種脫甲基T-2毒素，其結(jié)構(gòu)為：。本發(fā)明還公開(kāi)了其制備方法及檢測(cè)方法。脫甲基T-2毒素是一種還未見(jiàn)報(bào)道的新物質(zhì)，它是以T-2毒素作為前體，放入Tris-HCl緩沖液中發(fā)生脫甲基反應(yīng)，進(jìn)而獲得高純度的脫甲基T-2毒素。本技術(shù)主要包括脫甲基T-2毒素體外合成反應(yīng)、脫甲基T-2毒素的LC-MS/MS定量檢測(cè)。該方法轉(zhuǎn)化率高、產(chǎn)量大、純度高、成本低，不需要大型儀器和特殊培訓(xùn)的專業(yè)操作人員，樣品不需要特殊前處理，可以作為脫甲基T-2毒素標(biāo)準(zhǔn)品大量生產(chǎn)。
【IPC分類(lèi)】C07D493/10
【公開(kāi)號(hào)】CN105061450
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510491990
【發(fā)明人】王雅玲, 王雅沛, 孫力軍, 徐德峰
【申請(qǐng)人】廣東海洋大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年11月18日
【申請(qǐng)日】2015年8月12日