針對乙肝表面蛋白的雙特異性抗體及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明公開了抗乙肝表面蛋白雙特異性抗 體制備技術(shù)及其在預(yù)防HBV感染和治療HBV相關(guān)肝細胞肝癌中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 乙肝病毒Ofepatitis B virus，HBV)是雙鏈DNA病毒，人體被感染后易引起慢性 乙型肝炎，進而導(dǎo)致肝硬化和（或）肝癌。據(jù)統(tǒng)計近年來全球約有3.5億HBV感染者，每年 約有100萬~150萬人死于急性或慢性HBV感染導(dǎo)致的肝功能衰竭，肝硬化和（或）肝癌， 因而預(yù)防HBV感染成為世界公共健康問題[ 1]。肝細胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC， 簡稱肝癌）與病毒性肝炎的關(guān)系密切，是病毒性肝炎所引起的最重要死亡原因之一，亦是 臨床上最常見的惡性腫瘤之一，在世界范圍內(nèi)是位居第三的腫瘤相關(guān)致死原因，每年新發(fā) 病例中我國占全球42. 5%，已成為我國第二位的腫瘤病因。
[0003] 研究表明，HBV感染相關(guān)HCC患者中，HBV DNA載量高者（>105copies/ml)的HCC 發(fā)生率達10. 1%，而HBV DNA載量低者（<104copies/ml)的HCC發(fā)生率僅為3. 8%，基線高 病毒載量與HCC發(fā)生率升高有關(guān)。高病毒載量（HBV DNA彡0. 7mEq/ml)時，HCC復(fù)發(fā)危險 比為5. 13,切口緣陽性的HCC復(fù)發(fā)危險比為2. 14。因此，對乙肝患者進行抗病毒治療，有助 于延緩疾病向HCC的進展。對HBV相關(guān)HCC患者進行抗病毒治療，可通過改善肝功能而提 高生存率。近年的研究顯示，高HBV DNA載量與高HCC復(fù)發(fā)率及預(yù)后不良有關(guān)。對HBV感 染相關(guān)HCC術(shù)后患者進行抗病毒治療可能是除肝移植以外的另一種治療選擇，該治療可通 過改善肝功能而提高生存率。
[0004] 目前針對HBV感染主要采用α -干擾素和核苷酸類似物等藥物抗病毒治療，但該 兩類藥物長期使用療效欠佳，易于導(dǎo)致病毒突變，給治療帶來極大困難[2]。
[0005] 相對于抗病毒感染的藥物，乙肝特異性的免疫球蛋白（HBIG)的抗病毒效果好很 多。給予病人乙肝特異性的免疫球蛋白（HBIG)治療已給被各國的學者廣泛關(guān)注。諸如， HBIG在乙肝來源的肝癌后肝移植后的研究已達到很好的效果。HBIG是一種高效價的多克 隆外源性抗體，其是從健康獻血員中篩選出來，經(jīng)過生物濃縮工藝制成。當人體感染HBV 時被動地接受這種被動免疫制劑，可使機體能短期內(nèi)迅速中和并清除血清中游離的乙肝病 毒，避免乙肝病毒定位感染。
[0006] 然而，當前HBIG作為治療性抗體的來源存在諸多非安全因素。同時，乙肝免疫球 蛋白成分復(fù)雜，危險因素相對不確定，生產(chǎn)方式受限，這些因素制約著乙肝治療性抗體的臨 床使用[3]。
[0007] 因此迫切需要研發(fā)一種安全有效及危險因素相對可控的生物制品替代人乙肝 免疫球蛋白，所以研發(fā)乙肝特異性人源基因工程抗體越來越受到關(guān)注。因單克隆抗體具 有特異性強、靈敏度高且易大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點，故研發(fā)針對乙肝表面抗原（Hepatitis B surface Ag, HBsAg)的單克隆抗體，以期能夠安全有效地阻止HBV感染及其相關(guān)的肝炎、肝 硬化及肝癌的進程。
[0008] 由于疾病的多因素性，單一靶點治療往往不能滿足臨床的需求[4]。在臨床試驗中 已有聯(lián)合運用兩種單克隆臨床前實驗的報道 [5]，但這種聯(lián)合應(yīng)用單克隆抗體的卻有很多限 制性[6]。例如，聯(lián)合應(yīng)用兩種單克隆抗體的的安全性和效果需要分別去評價，由此產(chǎn)生的長 周期，高昂的開發(fā)費用限制其研制進程，而雙特異性抗體恰好解決了這一瓶頸 [7]。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明是為解決上述問題而進行的，提供了一種針對表面抗原蛋白的雙特異性抗 體A3B 5-BsAb,本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：
[0010] 本發(fā)明提供的針對乙肝表面蛋白的雙特異性抗體A3B5-BsAb,其特征在于，具有： 重鏈可變結(jié)構(gòu)域，包含高變區(qū)OTR 1、⑶R2、⑶R3、⑶R4、⑶R5、⑶R 6;以及輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，包含 高變區(qū)⑶R1' XDR2'、⑶R3'、⑶R4'、⑶R5'、⑶R 6'，重鏈可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列如 SEQ ID NO. 6所示，輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列如SEQ ID NO. 8所示。
[0011] 其中，⑶札的氨基酸序列為：Met-Tyr-Ala-Phe-Ser ;Q)R 2的氨基酸序列為 le_I Ie-Pro-Ser-Phe-Asp-Thr-Thr-Asn-Tyr-Ala-Gln-Lys-Phe-Gln-Cys ;CDR3的氨基酸序 列為：Ser-Val-I Ie-Thr-Asp-Leu-Asp-Thr-Val-Gly-Asn-Asp-Glu-Ser-Gly-Asp-Ala-Ser-Tyr-Tyr-Tyr-Met-Asp-Val ;001?4的氨基酸序列為：Ser-Ser-Ala-Ile-Leu ;001?5的氨基酸序 列為：Trp-IIe-Val-Val-Gly-Ser-Gly-Asn-Ala-Lys-Tyr-Ala-Gln-Arg-Phe-Gln-Glu ;CDR6 的氨基酸序列為：Arg-Gly-His-Ser-Phe-Thr-Ser-Pro-Phe-Asp-Ser ;
[0012] CDR1'的氨基酸序列為：Arg-Ser-Ser-Glu-Ser-Leu-Gln-His-Ser-Asp-Gl y-Thr-Tyr-Tyr-Leu-Asp ;CDR2'的氨基酸序列為：Ser-Ala-Ser-Asn-Thr-Ala-Pro ; CDR/ 的氨基酸序列為：Met-Gln-Ala-Leu-Glu-Thr-Pro-Phe-Thr ;CDR / 的氨基酸序 列為：Arg-Ala-Ser-Gln-Ser-Val-Gly-Ser-Asn-Tyr-Leu-Ala ;CDR5'的氨基酸序列為： Gly-Ala-Ser-Thr-Arg-Ala-Thr ;CDR6'的氨基酸序列為：Gln-Lys-Tyr-Gly-Ser-Ser-Leu-Thr0
[0013] 同時，雙特異性抗體A3B5-BsAb選自抗乙肝病毒表面抗原的雙特異性抗體以及所 述雙特異性抗體片段中的任意一種，該雙特異性抗體片段為所述雙特異性抗體的Fab片段 或F(ab'） 2片段。
[0014] 進一步的，本發(fā)明還提供了一種針對乙肝表面蛋白的抗體片段，該抗體片段為雙 特異性抗體A 3B5-BsAb的Fab片段或F (ab'）2片段。
[0015] 進一步的，本發(fā)明提供了一種編碼雙特異性抗體A3B5-BsAb的基因，編碼重鏈可變 結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示，編碼輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示。
[0016] 進一步的，本發(fā)明提供了一種含有至少一個拷貝的上述基因的表達載體。
[0017] 進一步的，本發(fā)明提供了一種含有至少一個上述的表達載體的宿主細胞。
[0018] 進一步的，本發(fā)明提供了雙特異性抗體A3B5-BsAb或其Fab片段或F(ab'） 2片段在 制備預(yù)防或治療乙肝病毒相關(guān)肝病的藥物或診斷試劑中的用途。所述藥物或診斷試劑除包 含抗體或抗體片段外，還包含可藥用賦形劑、稀釋劑與載體中的任意一種。
[0019] 發(fā)明作用與效果
[0020] 本發(fā)明提供了一種針對乙肝表面抗原蛋白的雙特異性抗體A3B5-BsAb,該雙特異性 抗體由抗體A3D5以及抗體B 5H6組合而成，但其中和HBV病毒的能力以及抑制HBsAg釋放的 能力較單純將抗體A3D5以及抗體B5H6聯(lián)合應(yīng)用更優(yōu)，顯現(xiàn)出較強的協(xié)同效果，進而可能阻止 HBV的感染相關(guān)的肝炎、肝硬化及肝癌的進程。同時，由于該抗體是從接種乙肝疫苗的志愿 者外周血中HBsAg特異的記憶性B細胞中克隆獲得的全人源抗體，其具有較鼠源、嵌合及人 源化抗體更低的免疫原性。
【附圖說明】
[0021 ] 圖1是本發(fā)明的雙特異性抗體A3B5-BsAb特異性結(jié)合抗原圖；
[0022] 圖2是本發(fā)明的合成肽在乙肝表面抗原（HBsAg)的位置示意圖；
[0023] 圖3⑷是本發(fā)明的雙特異性抗體A3B5-BsAb結(jié)合抗原表位P 3的結(jié)果圖；
[0024] 圖3 (B)是本發(fā)明的雙特異性抗體A3B5-BsAb結(jié)合抗原表位P2的結(jié)果圖；
[0025] 圖4是本發(fā)明的雙特異性抗體A3B5-BsAb影響細胞中HBsAg表達的定量檢測結(jié)果 圖；
[0026] 圖5是本發(fā)明的雙特異性抗體A3B5-BsAb影響細胞中HBV DNA復(fù)制數(shù)的定量檢測 結(jié)果圖；
[0