027] 圖6是本發(fā)明的雙特異性抗體A3B5-BsAb抑制肝癌細(xì)胞中HBsAg釋放的結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 以下結(jié)合實(shí)施例來對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說明，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。
[0029] 實(shí)施例不包括對(duì)傳統(tǒng)方法的詳細(xì)描述，如〖Overlapping PCR反應(yīng)，限制性酶切 反應(yīng)，將基因插入到質(zhì)粒載體，將質(zhì)粒引入宿主細(xì)胞的方法等。這樣的方法對(duì)于本領(lǐng)域 中具有普通技術(shù)的人員是眾所周知的，并且在許多出版物中都有所描述，例如Sambrook， J. , Fritsch, E. F. and Maniais，Τ· (1989)Molecular Cloning ：A Laboratory Manual， 2ndedition，Cold spring Harbor Laboratory Press。且下述實(shí)施例中所用的材料、試劑 等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0030] 試劑與材料
[0031] 淋巴細(xì)胞分離液，購自北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司；Trizol試劑，購自 Invitrogen公司；無血清培養(yǎng)基EX-CELL 302,購自 SIGMA-ALDRICH公司；Goat anti-human kappa-HRP 購自 Invivogen 公司；
[0032] 實(shí)施例一：雙特異性抗體A3B5-BsAb的制備
[0033] 一、抗體輕鏈恒定區(qū)、重鏈恒定區(qū)基因的克隆及其載體的構(gòu)建
[0034] 用淋巴細(xì)胞分離液分離健康人淋巴細(xì)胞，用Trizol試劑提取總RNA，根據(jù)文獻(xiàn)[8] 和文獻(xiàn)[9]報(bào)道的序列分別設(shè)計(jì)引物采用QIAGEN OneSt印RT-PCR Kit擴(kuò)增人抗體的重鏈 和輕鏈恒定區(qū)基因。將人抗體的重鏈和輕鏈恒定區(qū)基因分別連接到表達(dá)載體AbVec質(zhì)粒 中，分別構(gòu)建了抗體重鏈恒定區(qū)核苷酸載體IgG-AbVec質(zhì)粒以及抗體輕鏈恒定區(qū)核苷酸載 體Ig κ -AbVec質(zhì)粒，測序驗(yàn)證后確認(rèn)獲得了正確的克隆。其中，人抗體重鏈恒定區(qū)核苷酸 序列及氨基酸序列分別為SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2,人抗體輕鏈恒定區(qū)核苷酸序列及氨 基酸序列分別為SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4。
[0035] 二、抗體重鏈可變區(qū)、輕鏈可變區(qū)序列獲得以及重組表達(dá)載體的構(gòu)建
[0036] 具體地，采用超高速流式分選系統(tǒng)分離接種乙肝疫苗的志愿者外周血中HBsAg特 異的記憶性B細(xì)胞（HBsAg+IgG+⑶19+)，并制備成單細(xì)胞樣本。緊接著，采用Single Cell RT-PCR技術(shù)克隆每個(gè)樣本中抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)序列，由于單個(gè)細(xì)胞合成的cDNA特別 稀少，必須采用巢氏PCR的方法擴(kuò)增其含有的抗體基因。
[0037] 兩輪PCR后可見明顯的PCR條帶擴(kuò)增（大小約400bp)。分析其序列后，特異性PCR 擴(kuò)增抗體可變區(qū)條帶，重鏈引入限制性內(nèi)切酶Age I和限制性內(nèi)切酶Sal I位點(diǎn)，輕鏈引入 限制性內(nèi)切酶Age I和限制性內(nèi)切酶Bsiw I位點(diǎn)。將抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)基因分別克 隆入IgG-AbVec質(zhì)粒和Ig κ -AbVec質(zhì)粒，由此種方法，構(gòu)建多個(gè)全人源乙肝表面蛋白單克 隆抗體，其中選取兩株具有較高的HBV中和活性的抗體，分別命名為A 3D5及B 5H6。A3D5抗體 的重、輕鏈的載體分別命名為=IgG-AbVec-A 3D5, IgK -AbVec-A3D55B5Hf^體的重、輕鏈的載 體分別命名為=IgG-AbVec-B 5H6, IgK -AbVec-B5H6。
[0038] 采用Overlapping PCR的方法，將A3D5重鏈可變區(qū)的C端通過Linker短肽 "ASTKGPSVFPLAP (核苷酸序列為：GCT AGC ACC AAG GGA CCT TCT GTG TTC CCT CTG GCC CCT) "與B5H6抗體重鏈可變區(qū)的N端相連，引入限制性內(nèi)切酶Age I和限制性內(nèi)切酶Sal I位點(diǎn)，構(gòu)成A3B5-BsAb雙特異性抗體的重鏈可變區(qū)，其核苷酸序列及氨基酸序列分別為 SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6,將A3B5-BsAb重鏈可變區(qū)克隆入IgG-AbVec載體構(gòu)成其重 鏈表達(dá)載體IgG-AbVec-A 3B5-BsAb。同樣方法，將A3D5輕鏈可變區(qū)的C端通過Linker短肽 "TVAAPSVFIFPP (核苷酸序列為：ACC GTG GCT GCC CCT AGC GTG TTC ATC TTC CCT CCT)" 與B5H6抗體輕鏈可變區(qū)的N端相連，并引入限制性內(nèi)切酶Age I和限制性內(nèi)切酶Bsiw I位 點(diǎn)，構(gòu)成A3B5-BsAb雙特異性抗體的輕鏈可變區(qū)，其核苷酸序列及氨基酸序列分別為SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO:8,將A3B5-BsAb輕鏈可變區(qū)克隆入Ig κ -AbVec載體構(gòu)成其輕鏈表達(dá)載 體 Ig κ -AbVec_A3B5-BsAb。
[0039] 三、雙特異性抗體A3B5-BsAb表達(dá)及純化
[0040] 于3. 5cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中接種5 X IO5CHO-K1細(xì)胞，將細(xì)胞培養(yǎng)至90% -95 %融合 時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，具體步驟如下：取5 μ g質(zhì)粒IgG-AbVec_A3D5、5 μ g質(zhì)粒Ig κ -AbVec-A3D5及 20 μ LLipofectamine 2000Reagent，按 Lipofectamine 2000Reagent 試劑盒說明書進(jìn)行轉(zhuǎn) 染。轉(zhuǎn)染進(jìn)行24h后，將細(xì)胞培養(yǎng)基換為含600 μ g/mL G418的DMEM培養(yǎng)基篩選抗性克隆。
[0041] 將篩選得到的穩(wěn)定表達(dá)抗體的CH〇-K#H胞株用無血清培養(yǎng)基EX-CELL 302擴(kuò)大 培養(yǎng)，用Protein A Sepharose 4Fast Flow純化系統(tǒng)，按說明書親和純化得到雙特異性抗 體A3B5-BsAb。將純化得到的抗乙雙特異性抗體用PBS進(jìn)行透析，最后用紫外吸收法測定 A3B5-BsAb抗體的含量。
[0042] 采用聚丙烯酰氨凝膠電泳方法，鑒定抗體的結(jié)構(gòu)。純化后的抗體分別在非還原 和還原條件下用聚丙烯酰氨凝膠電泳檢測其分子量大小。電泳結(jié)果顯示：在還原條件下， A3B5-BsAb抗體呈現(xiàn)為分子量大小約65KDa和35KDa的重鏈和輕鏈條帶。在非還原條件下， A3B5-BsAb抗體呈現(xiàn)出分子量約為200KDa的單一條帶。
[0043] 由此可以推測出針對(duì)乙肝表面抗原的雙特異性抗體A3B5-BsAb的結(jié)構(gòu)：該抗體由 兩條相同的輕鏈和兩條相同的重鏈組成，輕鏈由輕鏈可變區(qū)和輕鏈恒定區(qū)組成，重鏈由重 鏈可變區(qū)和重鏈恒定區(qū)組成，其中一條輕鏈分別與一條重鏈通過二硫鍵連接，形成兩個(gè)半 分子，兩個(gè)半分子的兩條重鏈之間通過二硫鍵連接形成所述抗體。至此，我們構(gòu)建并表達(dá)出 完整的雙特異性抗體A3B5-BsAb。
[0044] 實(shí)施例二、雙特異性抗體A3B5-BsAb的特異性
[0045] 用Elisa方法檢測雙特異性抗體A3B5-BsAb特異性結(jié)合HBsAg蛋白的能力。
[0046] 將重組HBsAg蛋白及對(duì)照蛋白cIg包被酶聯(lián)免疫板，經(jīng)封閉液封閉后，分別加入空 白組、不同濃度的對(duì)照蛋白clg及表達(dá)純化的不同濃度的A 3D5抗體孵育，洗板后加入Goat anti-human kappa-HRP，TMB顯色液顯色，酶標(biāo)儀在450nm波長下讀值。
[0047] 依據(jù)抗體濃度及對(duì)應(yīng)的OD值繪制圖1，由圖1分析可得，隨著抗體濃度的增高，其 包被HBsAg蛋白組對(duì)應(yīng)讀值也相應(yīng)增高。而包被對(duì)照蛋白組讀值與空白組讀值相近且不隨 抗體濃度變化而變化，且對(duì)照蛋白clg組讀值并未依賴自身濃度變化而發(fā)生變化，故雙特 異性抗體A 3B5-BsAb能夠特異性結(jié)合HBsAg蛋白。
[0048] 實(shí)施例三、雙特異性抗體A3B5-BsAb結(jié)合抗原表位鑒定
[0049] 綜合以往文獻(xiàn)報(bào)道的乙肝表面抗原（HBsAg)具有中和活性的抗原性表位區(qū)域，合 成了生物素標(biāo)記的乙肝表面抗原短肽，來測定全人源乙肝表面蛋白單克隆抗體在HBsAg上 的結(jié)合區(qū)域。如圖2中的HBsAg模式圖所示，合成的四條生物素標(biāo)記乙肝表面抗原短肽 PJaa: 104-120)、P2 (aa: 121-137)、P3(aa: 139-148)、P4(aa: 149-163)，P1-Pja氨基酸序列如 SEQ ID NO. 9~SEQ ID NO. 12所示。其中，抗原短肽PjP P4為線性結(jié)構(gòu)，P JPP3為環(huán)狀 結(jié)構(gòu)[1°]。
[0050] 前期實(shí)驗(yàn)表明，結(jié)合在構(gòu)象表位區(qū)段（PjP P3區(qū)域）的單克隆抗體中和HBV活性 要好于結(jié)合在線性表位區(qū)段（PJPP4區(qū)域）的單克隆抗體。采用ELISA的方法分析了 A3D5