元元素減半，而蔗糖含量為30mg I1的培養(yǎng)基。
[0020]本發(fā)明先采用植物組織培養(yǎng)技術(shù)獲得大量供基因轉(zhuǎn)化所用的佛甲草無(wú)菌苗，建立以芽器官發(fā)生途徑再生植株的方法；根據(jù)實(shí)際研究或育種目標(biāo)的需要構(gòu)建含由煙草花椰菜花葉病毒的CaMV35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的目標(biāo)基因和篩選標(biāo)記基因的植物表達(dá)載體，將表達(dá)載體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌，使根癌農(nóng)桿菌與葉片、葉柄、莖節(jié)外植體共培養(yǎng)，使用篩選標(biāo)記基因相應(yīng)的抗生素篩選得到的抗性芽、抗性植株，經(jīng)GUS染色、Southern雜交檢測(cè)技術(shù)證明均是轉(zhuǎn)基因的材料。從無(wú)菌苗切取葉片、葉柄、莖節(jié)外植體進(jìn)行根癌農(nóng)桿菌浸染到獲得可以移栽的轉(zhuǎn)基因植株，整個(gè)操作過(guò)程為9周。一次操作100個(gè)葉片外植體，可以獲得大約25至50個(gè)株系的轉(zhuǎn)基因芽，每個(gè)轉(zhuǎn)基因芽經(jīng)3周培養(yǎng)可以產(chǎn)生10個(gè)以上的叢生芽，再生植株的生根率為100%，轉(zhuǎn)基因植株移栽到土壤的存活率達(dá)100%。
[0021]利用本發(fā)明方法在9周內(nèi)就可以獲得大量轉(zhuǎn)基因佛甲草新品種，滿足目前對(duì)佛甲草優(yōu)良株系培育技術(shù)的迫切需要，同時(shí)還為佛甲草種質(zhì)資源的創(chuàng)新、研發(fā)、可持續(xù)發(fā)展、培育優(yōu)良新品種、生物學(xué)的研究等提供一種有效的研究方法，在佛甲草可持續(xù)發(fā)展中具有顯著的生態(tài)、經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益意義。
[0022]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn):
[0023](I)快速培育佛甲草遺傳改良新品種
[0024]利用本發(fā)明方法可以根據(jù)育種、景觀或生態(tài)需要有目的性地改良佛甲草的性狀，操作簡(jiǎn)單，能夠在9周內(nèi)獲得大量的具有優(yōu)良性狀的佛甲草新品種，滿足目前對(duì)佛甲草優(yōu)良株系培育技術(shù)的迫切需要，在佛甲草可持續(xù)發(fā)展中具有顯著的生態(tài)、經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益意義。同時(shí)還為佛甲草種質(zhì)資源的創(chuàng)新、研發(fā)、可持續(xù)發(fā)展、培育優(yōu)良新品種、生物學(xué)的研究等提供一種有效的研究方法。
[0025](2)高效的佛甲草組織培養(yǎng)植株再生體系
[0026]本發(fā)明建立的佛甲草組織培養(yǎng)植株再生體系非常高效:以21天為I個(gè)繼代增殖周期，每I個(gè)繼代增殖周期由I個(gè)芽枝可增殖形成10-15個(gè)芽枝；從無(wú)菌苗切取葉片、葉柄、莖節(jié)外植體到再生植株移栽土壤成活，整個(gè)操作過(guò)程為7周，有95%以上的外植體均能產(chǎn)生再生芽，生根率100%，100%的再生植株均能成功移栽土壤存活；來(lái)源于無(wú)菌苗的葉片、葉柄、莖節(jié)均能成為有效的轉(zhuǎn)化受體，無(wú)菌苗可長(zhǎng)期在實(shí)驗(yàn)室條件下無(wú)菌保存，外植體的來(lái)源不受限制，隨時(shí)可以進(jìn)行轉(zhuǎn)基因的操作。
[0027](3)嚴(yán)格有效的篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方法
[0028]分別經(jīng)1mg I 1潮霉素、5mg I 1草胺磷、10mg I 1卡那霉素篩選壓得到的抗性株，經(jīng)⑶S染色、Southern雜交實(shí)驗(yàn)證明均是轉(zhuǎn)基因的材料。這樣確保了通過(guò)該技術(shù)方法所獲得的抗性植株是轉(zhuǎn)基因植株、減少了后期采用分子檢測(cè)的工作量。
[0029](4)轉(zhuǎn)化效率高、重復(fù)性高
[0030]本發(fā)明提供的技術(shù)方法經(jīng)多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，證明轉(zhuǎn)化率為25-50%。因轉(zhuǎn)化所用的外植體易大量獲得，所以一次轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)操作就可以獲得所需的轉(zhuǎn)基因株系。
[0031](5)育種效率高
[0032]通過(guò)以上操作，每個(gè)轉(zhuǎn)化外植體均能產(chǎn)生叢生芽，叢生芽又能通過(guò)繼代增殖，每I個(gè)繼代增殖周期由I個(gè)芽枝可增殖形成10個(gè)以上芽枝，且都能生根發(fā)育成植株，因此應(yīng)用本發(fā)明方法在9周內(nèi)能獲得大量的轉(zhuǎn)基因株，100%轉(zhuǎn)基因株能夠成功地移栽到土壤中，保證了分子育種方法培育的品種栽培成功。
【附圖說(shuō)明】
[0033]圖1為佛甲草通過(guò)芽器官發(fā)生途徑再生植株。其中，A為葉片外植體接種于芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)16天時(shí)外植體的切口有再生芽的發(fā)生出為葉片外植體在芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)35天時(shí)的再生芽；C為將有2cm高的再生植株移栽裝有蛭石盆中生長(zhǎng)35天時(shí)的生長(zhǎng)情況。
[0034]圖2為植物表達(dá)載體的T-DNA區(qū)域示意圖。其中，35S pro為煙草花椰菜花葉病毒的CaMV35S的啟動(dòng)子。
[0035]圖3為接種于抗性芽誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基21天時(shí)的轉(zhuǎn)pCAMBIA1301質(zhì)粒的抗性芽。
[0036]圖4為與根癌農(nóng)桿菌EHA105/pCAMBIA1301共培養(yǎng)3天之后的佛甲草葉片外植體⑶S基因瞬時(shí)表達(dá)檢測(cè)結(jié)果。
[0037]圖5為⑶S染色呈現(xiàn)藍(lán)色的轉(zhuǎn)pCAMBIA1301質(zhì)粒的抗性芽。
[0038]圖6為無(wú)⑶S染色的未轉(zhuǎn)化芽枝和有⑶S染色的轉(zhuǎn)pCAMBIA1301質(zhì)粒的抗性芽枝。其中，圖A為接種于芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基2周時(shí)的經(jīng)⑶S染色而沒(méi)有呈現(xiàn)藍(lán)色的未轉(zhuǎn)化芽，圖B為接種到抗性芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基2周時(shí)轉(zhuǎn)pCAMBIA1301質(zhì)粒所得的經(jīng)⑶S染色呈現(xiàn)藍(lán)色的抗性芽。
[0039]圖7為Southern雜交檢測(cè)pCAMBIA1301質(zhì)粒轉(zhuǎn)化株的結(jié)果。其中，WT為未轉(zhuǎn)化株，顯示沒(méi)有雜交信號(hào)；τ?、Τ2、Τ3、Τ4、Τ5為PCAMBIA1301質(zhì)粒轉(zhuǎn)化株，均有雜交信號(hào)且均是不同轉(zhuǎn)化株系。
[0040]圖8為移栽土壤28天時(shí)的未轉(zhuǎn)化植株和轉(zhuǎn)pCAMBIA1301質(zhì)粒的植株。圖A和圖B分別是未轉(zhuǎn)化植株和轉(zhuǎn)PCAMBIA1301質(zhì)粒植株的再生植株約2cm時(shí)移栽土壤培養(yǎng)28天時(shí)的生長(zhǎng)情況。
【具體實(shí)施方式】
[0041]以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。
[0042]下列實(shí)例中未具體注明的實(shí)驗(yàn)方法，均可按照常規(guī)方法進(jìn)行，或按照所用產(chǎn)品生產(chǎn)廠商的使用說(shuō)明。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可通過(guò)商業(yè)途徑得到。
[0043]實(shí)施例1:無(wú)菌苗的獲得
[0044]從市場(chǎng)購(gòu)得佛甲草，取生長(zhǎng)良好的幼枝，用自來(lái)水沖洗干凈后，放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1 %的多菌靈溶液中浸泡5-10分鐘，取出后用自來(lái)水沖洗干凈，將枝條剪成5厘米左右長(zhǎng)度。用體積分?jǐn)?shù)75%酒精水溶液浸泡30秒，再用無(wú)菌水沖洗3遍后，將枝條移入質(zhì)量分?jǐn)?shù)
2.5%次氯酸鈉溶液(添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%吐溫80)消毒10分鐘，用無(wú)菌水沖洗6遍，然后將枝條置于無(wú)菌濾紙上吸干水分。將枝條分切成有一個(gè)節(jié)的切段，后逐個(gè)接種到1/2MS培養(yǎng)基。置于溫度25±1°C，光照度50 μπιο? JiT2S'光照12h/天條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)20天左右，葉腋伸長(zhǎng)發(fā)育為芽枝，接觸培養(yǎng)基處的切口長(zhǎng)出不定根。芽枝高約5cm時(shí)切出轉(zhuǎn)接入相同的新鮮1/2MS培養(yǎng)基相同條件下進(jìn)行繼代增殖。一般21天為I個(gè)繼代增殖周期，每I個(gè)繼代增殖周期由I個(gè)芽枝可增殖形成10-15個(gè)芽枝，獲得的芽枝即為要得到的無(wú)菌苗。
[0045]實(shí)施例2:再生植株的獲得
[0046]從無(wú)菌苗分別切取葉片、葉柄、莖節(jié)為外植體，接種于芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基添加 Img Iibenzyladenine(BA)^PCLlmg I ^-Naphthalene acetic acid (NAA)，pH 5.8)，置在溫度25±2°C，光照度50 μ mol m 2S \光照12h/天條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)16天時(shí)95%以上的外植體的切口處可觀察到有再生芽的發(fā)生(圖1A)，將光下培養(yǎng)16天附有再生芽的葉片外植體轉(zhuǎn)接相同的新鮮芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)可見(jiàn)有大量再生芽發(fā)育(圖1B)，將再生芽轉(zhuǎn)接芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基(1/2MS培養(yǎng)基，pH為5.8)相同條件下培養(yǎng)，芽枝伸長(zhǎng)發(fā)育，接觸培養(yǎng)基基部有大量不定根的產(chǎn)生，生根率100%，由此得到再生植株。
[0047]將2cm高的再生植株從培養(yǎng)瓶中移出，洗去根部培養(yǎng)基，定植在裝有蛭石的盆中，用保鮮膜罩住，在保鮮膜上打些小孔，5天后揭開(kāi)，存活率達(dá)100% (圖1C)。從無(wú)菌苗切取葉片、葉柄、莖節(jié)外植體到再生植株移栽土壤成活，整個(gè)操作過(guò)程為7周。
[0048]實(shí)施例3:用于