I 1草胺磷、10mg I 1卡那霉素可以確保所獲得的抗性植株是轉(zhuǎn)基因植株，減少后期采用分子手段檢測轉(zhuǎn)基因植株的工作量。
[0067]通過以上方法，9周內(nèi)可以獲得大量的轉(zhuǎn)基因植株，以1mg I 1潮霉素為篩選壓得到的轉(zhuǎn)PCAMBIA1301的抗潮霉素植株的轉(zhuǎn)化頻率為50%左右，以10mg I 1卡那霉素為篩選壓得到的轉(zhuǎn)PBI121的抗卡那霉素植株的轉(zhuǎn)化頻率為50%左右，而以5mg I 1草胺磷為篩選壓得到的轉(zhuǎn)PCAMBIA3301的抗草胺磷植株的轉(zhuǎn)化頻率則為25%左右。
[0068]實施例9:轉(zhuǎn)基因再生植株的移栽
[0069]從無菌苗切取葉片、葉柄、莖節(jié)外植體進(jìn)行根癌農(nóng)桿菌浸染到獲得可以移栽的轉(zhuǎn)基因植株，整個操作過程為9周。將高于2cm的轉(zhuǎn)基因植株(由實施例5-7制備的抗性植株)從培養(yǎng)瓶中移出，洗去根部培養(yǎng)基，定植在裝有蛭石的盆中，用保鮮膜罩住，在保鮮膜上打些小孔，5天后揭開，存活率達(dá)100%。
[0070]將實施例5制備的高約為2cm的轉(zhuǎn)pCAMBIA1301的抗潮霉素再生植株和高約為2cm的未轉(zhuǎn)化株的再生植株(根據(jù)實施例1和實施例2所述方法制備得到，作為對照)分別從培養(yǎng)瓶中移出，洗去根部培養(yǎng)基，定植在裝有蛭石的盆中，用保鮮膜罩住，在保鮮膜上打些小孔，5天后揭開，定植28天后，觀察比較二者的生長情況，如圖8所示。從圖中可以看出，轉(zhuǎn)PCAMBIA1301的抗潮霉素再生和未轉(zhuǎn)化株的再生植株生長狀況基本相同，表明佛甲草遺傳轉(zhuǎn)化再生體系構(gòu)建成功。
【主權(quán)項】
1.一種快速獲得大量轉(zhuǎn)基因佛甲草新品種的分子育種方法，其特征在于，包括以下步驟: a、無菌苗及外植體的獲得:取佛甲草幼嫩枝條，消毒后，將枝條分切成有一個節(jié)的切段，后逐個接種到1/2MS培養(yǎng)基，置于溫度25土 1°C，光照度50 μ mol m_2s _1，光照12h/天條件下培養(yǎng)，葉腋伸長發(fā)育為枝，接觸培養(yǎng)基處的切口長出不定根，將芽枝切出轉(zhuǎn)接入1/2MS培養(yǎng)基相同條件下進(jìn)行繼代增殖，增殖得到的芽枝即為無菌苗，從無菌苗分別切取葉片、葉柄、莖節(jié)作為外植體； b、將步驟a制備的外植體浸泡于含有攜帶目標(biāo)基因的植物表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌菌液中，該植物表達(dá)載體含有篩選標(biāo)記基因，然后取出外植體，吸干多余的菌液后將外植體移至共培養(yǎng)基中，置25± I°C，黑暗下培養(yǎng)，然后取出共培養(yǎng)后的外植體，漂洗后吸干外植體上殘余水分，將外植體移至抗性芽誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中，置25土 TC，光下培養(yǎng)，待長出抗性芽后，將其轉(zhuǎn)接至抗性芽誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)，然后再轉(zhuǎn)接至抗性芽伸長培養(yǎng)基中，置25 土 1°C，光下培養(yǎng)，抗性芽伸長并產(chǎn)生不定根，獲得抗性植株； 所述的共培養(yǎng)基為:MS培養(yǎng)基添加Img I 1BAj.1mg I 1NAA和20mg I 1乙酰丁香酮，pH為 5.5 ; C、轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測:利用植物表達(dá)載體上的篩選標(biāo)記基因、報告基因或者目標(biāo)基因的序列進(jìn)行PCR分子檢測法、Southern雜交方法或者RT-PCR檢測法，檢測抗性芽或者抗性植株是否已是轉(zhuǎn)基因材料； d、轉(zhuǎn)基因植株的移栽:將檢測含有目標(biāo)基因的生根的轉(zhuǎn)基因植株從培養(yǎng)瓶中移出，洗去根部培養(yǎng)基，定植在裝有栽培基質(zhì)的盆中，得到移栽成功的轉(zhuǎn)基因植株。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速獲得大量轉(zhuǎn)基因佛甲草新品種的分子育種方法，其特征在于，所述的步驟b的含有攜帶目標(biāo)基因的植物表達(dá)載體為含有目標(biāo)基因的pCAMBIA1301載體，其篩選標(biāo)記基因為潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶篩選基因，所述的步驟b的抗性芽誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基中添加Img I1BAjlmg I 1NAA, 1mg I 1潮霉素和500mg I 1頭孢霉素，pH為5.8 ;所述的步驟b的抗性芽伸長培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基添加1mg I 1潮霉素和250mgI 1頭孢霉素，pH為5.8。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速獲得大量轉(zhuǎn)基因佛甲草新品種的分子育種方法，其特征在于，所述的步驟b的含有攜帶目標(biāo)基因的植物表達(dá)載體為含有目標(biāo)基因的pCAMBIA3301載體，其篩選標(biāo)記基因為草胺磷抗性基因，所述的步驟b的抗性芽誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基添加Img I 1BAj.1mg I 1NAAjmg I 1草胺磷和500mg I 1頭孢霉素，pH為5.8 ;所述的步驟b的抗性芽伸長培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基添加5mg I 1草胺磷和250mg I 1頭孢霉素，pH為 5.8o4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速獲得大量轉(zhuǎn)基因佛甲草新品種的分子育種方法，其特征在于，所述的步驟b的含有攜帶目標(biāo)基因的植物表達(dá)載體為含有目標(biāo)基因的pBI 121載體，其篩選標(biāo)記基因為卡那霉素抗性基因；所述的步驟b的抗性芽誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基添加Img I1BAjlmg I1NAAUOOmg I 1卡那霉素和500mg I 1頭孢霉素，pH為5.8 ;所述的步驟b的抗性芽伸長培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基添加10mg I 1卡那霉素和250mg I 1頭孢霉素，pH 為 5.8。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速獲得大量轉(zhuǎn)基因佛甲草新品種的分子育種方法，其特征在于，所述的含有攜帶目標(biāo)基因的植物表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌是通過以下方法構(gòu)建的:將目標(biāo)基因插入表達(dá)載體啟動子之后，通過凍融法將構(gòu)建好的攜帶目標(biāo)基因的植物表達(dá)載體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌，經(jīng)抗性篩選，獲得含有攜帶目標(biāo)基因的植物表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速獲得大量轉(zhuǎn)基因佛甲草新品種的分子育種方法，其特征在于，所述的步驟a的消毒，是將佛甲草幼嫩枝條用自來水沖洗干凈后，放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的多菌靈溶液中浸泡5-10分鐘，然后取出用自來水沖洗干凈，再用體積分?jǐn)?shù)75%酒精浸泡30秒，無菌水沖洗3遍后，將枝條移入含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%吐溫80的質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%次氯酸鈉溶液消毒10分鐘，用無菌水沖洗6遍。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速獲得大量轉(zhuǎn)基因佛甲草新品種的分子育種方法，其特征在于，所述的步驟b的漂洗，是用含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05 %吐溫80的無菌水沖洗5?6次，然后用含有500mg I 1頭孢霉素的無菌水沖洗一次。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速獲得大量轉(zhuǎn)基因佛甲草新品種的分子育種方法，其特征在于，所述的步驟d的栽培基質(zhì)為蛭石。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速獲得大量轉(zhuǎn)基因佛甲草新品種的分子育種方法，其特征在于，所述的b步驟中將外植體浸泡于含有攜帶目標(biāo)基因的植物表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌菌液中的步驟是先將含有攜帶目標(biāo)基因的植物表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌懸浮在含有20mg/l乙酰丁香酮的MS培養(yǎng)基中，其pH為5.2，常規(guī)培養(yǎng)至0D6。。= 0.4?0.5，然后將外植體浸泡于該根癌農(nóng)桿菌菌液中，時間為lOmin。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種快速獲得大量轉(zhuǎn)基因佛甲草新品種的分子育種方法。本發(fā)明以無菌苗的葉片、葉柄、莖為轉(zhuǎn)化受體，根據(jù)育種目的的需要構(gòu)建目標(biāo)基因的植物表達(dá)載體，通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法將目標(biāo)基因?qū)敕鸺撞莼蚪M，通過芽器官發(fā)生途徑分化形成再生植株；在轉(zhuǎn)化芽誘導(dǎo)、轉(zhuǎn)化芽伸長及生根時添加篩選標(biāo)記基因的相應(yīng)的抗生素篩選轉(zhuǎn)化體，通過Southern雜交、GUS染色證明所獲得的抗性株均為轉(zhuǎn)化株。本發(fā)明方法9周即可獲得大量的轉(zhuǎn)目標(biāo)基因的佛甲草新品種，可滿足目前佛甲草優(yōu)良株系培育、種質(zhì)資源創(chuàng)新研究的迫切需要。本發(fā)明在佛甲草可持續(xù)發(fā)展中具有顯著的生態(tài)、經(jīng)濟(jì)和社會效益意義。
【IPC分類】C12N15/84, A01H5/00
【公開號】CN105063086
【申請?zhí)枴緾N201510518685
【發(fā)明人】吳國江, 李美茹
【申請人】中國科學(xué)院華南植物園
【公開日】2015年11月18日
【申請日】2015年8月21日