[0101]此外，所述的低葡萄糖濃度指饑餓處理時的葡萄糖濃度Ml遠低于該CTC細胞(或其對應(yīng)的腫瘤細胞)正常培養(yǎng)條件下葡萄糖濃度MO，通常M1/M0S 1/2，較佳地< 1/5，更佳地彡1/10。
[0102]在本發(fā)明中，當饑餓處理時的葡萄糖濃度Ml遠低于該CTC細胞(或其對應(yīng)的腫瘤細胞)正常培養(yǎng)條件下葡萄糖濃度MO的1/50或更低(M1/M0 ( 1/50，較佳地彡1/100)時，可視為在無葡萄糖的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。
[0103]本發(fā)明的結(jié)果表明，經(jīng)饑餓處理后，分離的CTC細胞對于葡萄糖類似物(如2-NBDG)，有更一致和更可比較的吸收，因此使得檢測結(jié)果更可靠。
[0104]其他處理
[0105]本發(fā)明的研究表明，凋亡細胞是不會攝取2-NBDG的，活細胞會攝取2-NBDG，而且越惡性的腫瘤細胞其攝取越快越多。
[0106]然而，死細胞一般細胞膜表面破損，熒光的2-NBDG會擴散進去，從而導(dǎo)致也有熒光，所以事先對死細胞的封閉就比較重要，能夠避免2-NBDG擴散進死細胞后的非特異性吸附，從而提高檢測靈敏度和準確性。
[0107]因此，在本發(fā)明中，在另一優(yōu)選例中，在復(fù)蘇處理中，還包括加入牛血清白蛋白對細胞、微孔芯片進行封閉，消除對2-NBDG的非特異性吸附。
[0108]在另一優(yōu)選例中，在復(fù)蘇處理中，還包括加入針對白細胞表面抗原的熒光修飾抗體(如ant1-CD45-FITC)以識別白細胞，從而將CTC與白細胞區(qū)分開。
[0109]在另一優(yōu)選例中，在復(fù)蘇處理中，加入死細胞染料(如EthD-1，ethdiumhomodimer-1)，從而識別出死細胞。
[0110]檢測裝置
[0111]本發(fā)明還提供了一種用于檢測循環(huán)腫瘤細胞代謝活性的裝置。
[0112]典型地，本發(fā)明裝置包括:
[0113](a) CTC捕獲“魚骨形”芯片；
[0114](b)微孔陣列芯片；
[0115](C)第一容器，以及位于所述第一容器內(nèi)的帶有可檢測標記物的葡萄糖類似物(如 2-NBDG)；
[0116](d)任選的用于捕獲循環(huán)腫瘤細胞的磁珠，所述磁珠上負載有與腫瘤表面抗原特異性結(jié)合的抗體；和
[0117](e)任選的磁場裝置，所述磁場裝置包括永久磁鐵或電磁鐵。
[0118]在另一優(yōu)選例中，所述的裝置還包括選自下組的一個或多個組成部分:
[0119](f)第二容器，以及位于所述第二容器內(nèi)的封閉劑(如牛血清白蛋白)；
[0120](g)第三容器，以及位于所述第三容器內(nèi)的用于區(qū)分循環(huán)腫瘤細胞和白細胞的抗體，例如針對白細胞表面抗原的熒光修飾抗體(如ant1-CD45-FITC)
[0121](h)第四容器，以及位于所述第四容器內(nèi)的用于識別死細胞的死細胞染料(如EthD-1，ethdium homodimer-1)。
[0122]本發(fā)明的主要優(yōu)點包括:
[0123](a)本發(fā)明方法可以低成本的、快速、準確地檢測極少數(shù)目的CTC的葡萄糖攝取能力并對其進行功能分型。本發(fā)明方法不僅能夠?qū)哂谢钚缘腃TC進行計數(shù)，而且能夠識別具有高度活性與惡性的CTC，為進一步的針對這些CTC進行分子檢測提供基礎(chǔ)。
[0124](b)本發(fā)明通過微控陣列芯片與磁場操縱確保了極少數(shù)目的CTC在整個代謝活性檢測過程中不被丟失，這是稀有細胞檢測的瓶頸所在。
[0125](c)本發(fā)明提供了一種針對CTC功能的表征手段。CTC的重要性在于它不但代表了原位腫瘤病灶，同時也是腫瘤血行轉(zhuǎn)移的直接來源，而CTC本身卻存在著巨大的功能異質(zhì)性，即使這些CTC具有相似的基因組特征。直接對CTC進行功能表征有助于了解原發(fā)腫瘤的狀態(tài)以及評估CTC的轉(zhuǎn)移潛能。本發(fā)明提供了針對CTC代謝活性的簡單、廉價、可靠的表征手段，并可對CTC進行代謝活性的分型，以便于計數(shù)具有高代謝活性的CTC并對其進行進一步的分子檢測，如基因組、表觀基因組的檢測。
[0126]下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆:實驗室手冊(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)是重量百分比和重量份數(shù)。
[0127]材料
[0128]在實施例中，所有培養(yǎng)基、細胞系、抗體、磁珠等均為市售購得。
[0129]實施例1
[0130]極少數(shù)目細胞的葡萄糖類似物攝取檢測
[0131]提供一微孔陣列PDMS芯片，其結(jié)構(gòu)如圖1所示。
[0132]取表面結(jié)合免疫磁球的肺癌細胞A549、H1650、H1975各30個，分別懸于約200微升PBS中，置于所述的微孔陣列PDMS芯片(圖1)中，通過操縱磁場確保每個細胞均進入并固定在微孔中。
[0133]如圖2所示，使用不含葡萄糖的細胞培養(yǎng)液RPM1-1640孵育細胞10分鐘，從而對各腫瘤細胞進行饑餓處理。然后，加入含2-NBDG(濃度為0.3mM)的細胞培養(yǎng)液RPM1-1640繼續(xù)孵育細胞20分鐘。孵育結(jié)束后，在冰上用4°C的PBS充分、反復(fù)清洗細胞，同時施加磁場確保細胞被固定在微孔中，最后在顯微鏡下對芯片上的細胞進行明場與熒光成像。
[0134]結(jié)果如圖3顯示。在整個檢測過程中，由于磁場的約束，細胞并未損失。檢測結(jié)果顯示，具有EGFR突變的H1650細胞與H1975細胞相對于EGFR野生型的A549細胞顯示了更高的2-NBDG葡萄糖類似物的攝取能力，具有統(tǒng)計學意義。這一檢測結(jié)果與以下情況基本相符:具有主要癌基因突變或抑癌基因失活的細胞往往伴隨了代謝通路的上調(diào)，從而導(dǎo)致代謝活性的升高。
[0135]此外，與H1975細胞相比，H1650細胞的2-NBDG葡萄糖類似物的攝取能力更高(但未達到統(tǒng)計上顯著的程度)。這一檢測結(jié)果提示，H1650細胞具有更高的2-NBDG葡萄糖類似物與H1650細胞中抑癌基因PTEN失活存在一定相關(guān)性。
[0136]實施例2
[0137]外周血中CTC的葡萄糖類似物攝取檢測
[0138]本實施例中，方法包括以下步驟:
[0139](I)對于2毫升肺癌患者(自愿者)的外周血樣本，首先低速離心(200g)5分鐘除去上層的富血小板血漿，剩余細胞用Hank平衡鹽溶液(HBSS)重懸至2毫升，并加入一組生物素標記的抗體(針對的抗原分別為EpCAM，EGFR, HER2, MUCl。各抗體的最終濃度為I μ g/mL)共孵育I小時，多余抗體通過離心(300g，5分鐘)去除，然后加入鏈霉親和素標記的磁球(0.8微米)共孵育30分鐘，多余磁球通過離心(300g，5分鐘)去除，將細胞重懸在5毫升的HBSS中，形成經(jīng)預(yù)處理的樣本。
[0140](2)提供一魚骨型芯片，其結(jié)構(gòu)如圖4所示。
[0141](3)對于所述魚骨型芯片的微通道，用10%山羊血清與3%牛血清白蛋白混合溶液封閉一小時以避免細胞的非特異性吸附，再將5毫升上述處理后的細胞懸液通過恒流注射栗以5mL/h的流速通入芯片通道，并在芯片上方設(shè)置向上的磁場，從而實現(xiàn)在流動過程中動態(tài)捕獲CTC。結(jié)束后用HBSS以10mL/h的流速清洗芯片5分鐘以除去非特異性吸附的細胞，然后撤去磁場將CTC收集在約200微升的液體中，其中除了 CTC還包括極少數(shù)目非特異性捕獲的白細胞。
[0142](4)將上述約200微升細胞懸液置于微孔陣列PDMS芯片中，芯片上的納米孔事先用0.1%的I型膠原蛋白在37°C孵育2小時使其表面吸附有膠原蛋白，然后通過操縱磁場確保每個細胞均進入并固定在微孔中。
[0143](5)在微控芯片上加入人工配置的復(fù)蘇培養(yǎng)基(細胞培養(yǎng)液RPM1-1640、20ng/ml表皮生長因子EGF、20ng/ml纖維細胞生長因子basic FGFU:50稀釋的補充劑B-27)，置于37度、3%氧氣濃度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，然后用加了牛血清白蛋白的復(fù)蘇培養(yǎng)基(細胞培養(yǎng)液RPM1-1640、20ng/ml表皮生長因子EGF、20ng/ml纖維細胞生長因子basicFGFU:50稀釋的補充劑B-27、l%牛血液白蛋白BSA)孵育30分鐘起到封閉的作用。
[0144](6)芯片上的CTC培養(yǎng)結(jié)束后，使用不含葡萄糖的細胞培養(yǎng)液RPM1-1640孵育細胞10分鐘，使其饑餓，然后加入含2-NBDG(濃度為0.3mM)的細胞培養(yǎng)液RPM1-1640繼續(xù)孵育細胞20分鐘。
[0145](7)孵育結(jié)束后，在冰上用4°C的PBS充分、反復(fù)清洗細胞，同時施加磁場確保細胞被固定在納米孔中。
[0146](8)在顯微鏡下對芯片上的細胞進行明場與熒光成像。
[0147]結(jié)果如圖5所示，有5個CTC檢測到了較強的熒光信號，呈現(xiàn)了對2-NBDG的快速攝取，而白細胞則沒有可檢測到熒光信號，即對2-NBDG的攝取。這些CTC在后續(xù)的單細胞測序均檢測到了 KRAS突變。
[0148]對比例I
[0149]重復(fù)實施例2，其中使用的外周血樣本為來自同一肺癌患者(自愿者)的同一批次的外周血樣本。不同點在于，省略步驟(5)的芯片上培養(yǎng)過程，直接進行步驟(6)的饑餓與2-NBDG攝取實驗。
[0150]結(jié)果:檢測不到可區(qū)別于背景的來自細胞的熒光信號，即剛經(jīng)過體外分離的CTC的生長增殖受到抑制，代謝活性大大降低，以至于難以檢測。
[0151]實施例3
[0152]重復(fù)實施例2，