其中使用的外周血樣本為來自同一肺癌患者(自愿者)的同一批次的外周血樣本。不同點在于，在步驟(5)中，將肺癌細胞H1650培養(yǎng)皿中的上層條件培養(yǎng)液與肺成纖維細胞培養(yǎng)皿中的上層條件培養(yǎng)液按照1:1的比例組成新的條件培養(yǎng)液用于微控芯片中CTC的培養(yǎng)。
[0153]結(jié)果獲得了與實施例2中相似的結(jié)果，有6個CTC檢測到了明顯的熒光信號。
[0154]實施例4-6
[0155]重復(fù)實施例2，不同點在于:
[0156]在實施例4中，在復(fù)蘇處理中，還包括加入封閉劑牛血清白蛋白對細胞、微孔芯片進行封閉，消除對2-NBDG的非特異性吸附(實施例4);
[0157]在實施例5中，在復(fù)蘇處理中，還包括加入針對白細胞表面抗原的熒光修飾抗體(如ant1-CD45-FITC)以識別白細胞，從而將CTC與白細胞區(qū)分開；
[0158]在實施例6中，在復(fù)蘇處理中，加入死細胞染料(如EthD-1，ethdiumhomodimer-1)，從而識別出死細胞。
[0159]結(jié)果同樣獲得了與實施例2中相似的結(jié)果，實施例4-6中分別有5、6和5個CTC檢測到了明顯的熒光信號。
[0160]此外，由于在這些實施例4-6中添加了封閉劑牛血清白蛋白、針對白細胞表面抗原的熒光修飾抗體、和死細胞染料，因此挑選CTC細胞更為方便，也更不容易將CTC細胞與無關(guān)細胞混淆。
[0161]討論
[0162]目前，在臨床上通過使用可被腫瘤細胞吞噬或吞食的放射性物質(zhì)，通過放射性物質(zhì)的PET成像可用于顯示腫瘤的部位、形態(tài)、大小、數(shù)量及腫瘤內(nèi)的放射性分布，臨床上主要用于惡性腫瘤的診斷及良、惡性的鑒別診斷、臨床分期、評價療效及監(jiān)測復(fù)發(fā)等。
[0163]然而，腫瘤存在很大的異質(zhì)性，例如一側(cè)腫瘤的突變很可能不同于另一側(cè)，臨床上以上取樣的時候一般都取相對較惡性的組織來測序。CTC也有同樣的問題，如果CTC比較多，那么混在一起測序時，惡性CTC的信號就可能被稀釋或淹沒，或因為靈敏度不夠?qū)е聹y不出來。因此，從CTC細胞中簡便高效地選出最有代表性或惡性程度高的CTC就成為一個難題。
[0164]本發(fā)明基于具有熒光基團的葡萄糖類似物與相應(yīng)的方法、裝置來檢測血液中極為稀有的CTC的葡萄糖攝取能力，從而可對CTC進行代謝功能的分型，從而有效選出最有代表性或惡性程度高的CTC。
[0165]本發(fā)明針對數(shù)目極少的腫瘤患者外周血中的CTC(一般1-1000個)進行葡萄糖攝取檢測，其原理是檢測CTC對經(jīng)標(biāo)記的葡萄糖類似物的攝取能力，而該葡萄糖類似物與正常葡萄糖有類似的代謝途徑(尤其是在攝取環(huán)節(jié)非常相似)。此外，腫瘤細胞代謝的特點用高水平的有氧糖酵解替代正常組織細胞的氧化磷酸化。由于糖酵解的效率較低，因為腫瘤細胞需要攝取大量葡萄糖。
[0166]本發(fā)明主要包括三方面的的技術(shù)挑戰(zhàn):(I)在對數(shù)目極少的CTC進行葡萄糖類似物攝取檢測時需確保CTC不被丟失；(2)從腫瘤患者外周血樣本中富集分離CTC的過程需確保對CTC活性的損傷非常?。?3)由于CTC在體外的分離過程對其存在一定損傷，使其處于生長抑制及低代謝活性的狀態(tài)，因此需將CTC置于合適的細胞培養(yǎng)環(huán)境使其恢復(fù)原有的代謝活性。
[0167]本發(fā)明通過經(jīng)標(biāo)記的葡萄糖類似物來定量檢測稀有腫瘤細胞的葡萄糖攝取能力，如熒光基團標(biāo)記的D型葡萄糖類似物2-NBDG，它具有與D型葡萄糖相似的代謝途徑，通過葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白(GLUT)進入細胞內(nèi)，然后其C-6位置被己糖激酶磷酸化。研究已顯示，相比于良性細胞，2-NBDG可被惡性腫瘤細胞快速攝取，因此是一種檢測惡性腫瘤細胞的光學(xué)標(biāo)志物。在對稀有腫瘤細胞進行短暫的葡萄糖“饑餓”后，將其與2-NBDG共孵育一段時間后，用冰PBS清洗后通過熒光顯微鏡檢測細胞攝取2-NBDG后發(fā)出的熒光信號。
[0168]對于技術(shù)挑戰(zhàn)1，即對數(shù)目極少(少至一個)的稀有細胞進行檢測時，需確保在檢測過程中細胞不會丟失。因此，本發(fā)明所采用的方法是首先通過偶聯(lián)特異性抗體的免疫磁球?qū)TC從血液樣本中分離出來，然后CTC懸液加到一個微孔陣列(見圖1)上并適當(dāng)施加磁場使所有與磁球結(jié)合的CTC在磁場作用下均進入微孔，而微孔的數(shù)目(數(shù)千個)遠遠大于CTC的數(shù)目，從而確保沒有微孔內(nèi)至多只有一個CTC，且在檢測過程中CTC被磁場限制在微孔中，不會因加入試劑或者清洗步驟而丟失。
[0169]對于技術(shù)挑戰(zhàn)2，即從腫瘤患者外周血樣本中富集分離CTC的過程需確保對CTC活性的損傷非常小。通過紅細胞裂解以及密度梯度離心對血液進行預(yù)處理的方法對其他細胞存在一定損傷，需避免采用。本發(fā)明將免疫磁球與微流控芯片技術(shù)相結(jié)合能夠直接在不事先去除紅細胞或白細胞的情況下直接從血液中分離CTC。但是，血漿和部分血小板可以事先通過低速離心除去，剩余的細胞需重懸在含有葡萄糖的平衡溶液中，如Hank平衡鹽溶液(Hank’ s Balanced Salt Solut1n，HBSS)或者細胞培養(yǎng)基。
[0170]對于技術(shù)挑戰(zhàn)3，即體外分離過程對CTC存在一定損傷，使其處于生長抑制及低代謝活性的狀態(tài)，需將CTC置于合適的細胞培養(yǎng)環(huán)境確保其能夠恢復(fù)原有的代謝活性，其核心在于能夠有效模擬體內(nèi)腫瘤的微環(huán)境。這種微環(huán)境可能包括物理微環(huán)境如低氧氣濃度，化學(xué)微環(huán)境如各種生長因子、補充劑以及三維培養(yǎng)基等，生物微環(huán)境如與CTC共培養(yǎng)的“飼養(yǎng)”細胞或包含“飼養(yǎng)”細胞分泌物的上清液等。這里的“飼養(yǎng)”細胞包括與CTC同組織來源的腫瘤細胞或成纖維細胞，它們可以來自細胞系或患者組織樣本。一般來說，沒有統(tǒng)一的CTC培養(yǎng)方法，不同來源的CTC可以采用不同的培養(yǎng)方式，以便獲得最佳的培養(yǎng)效果。
[0171 ] 在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
【主權(quán)項】
1.一種非診斷性地檢測循環(huán)腫瘤細胞代謝活動的方法，其特征在于，包括步驟: (a)從外周血樣品中富集分離循環(huán)腫瘤細胞CTC，從而得到分離到的循環(huán)腫瘤細胞CTC ； (b)將上一步驟分離到的循環(huán)腫瘤細胞，置于微孔陣列芯片中，從而使得所述微孔陣列芯片的各個微孔中至多具有一個循環(huán)腫瘤細胞； (C)對上一步驟中的循環(huán)腫瘤細胞進行復(fù)蘇處理，從而獲得經(jīng)復(fù)蘇處理的循環(huán)腫瘤細胞； (d)在帶有可檢測標(biāo)記物的葡萄糖類似物存在下，培養(yǎng)所述的經(jīng)復(fù)蘇處理的循環(huán)腫瘤細胞；和 (e)檢測所述循環(huán)腫瘤細胞對所述帶有可檢測標(biāo)記物的葡萄糖類似物的攝取情況，從而定性或定量地確定所述循環(huán)腫瘤細胞代謝活動和/或惡性程度。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(c)和(d)之間，還包括步驟:對經(jīng)復(fù)蘇處理的循環(huán)腫瘤細胞進行饑餓處理。3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的饑餓處理是將所述循環(huán)腫瘤細胞置于低葡萄糖濃度或無葡萄糖的培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)一段時間。4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的復(fù)蘇處理包括選自下組的一種或多種: (i)物理環(huán)境復(fù)蘇，其中所述物理環(huán)境復(fù)蘇是指低氧環(huán)境，即氧氣體積分?jǐn)?shù)低于10% ;(?)化學(xué)環(huán)境復(fù)蘇，其中所述化學(xué)環(huán)境是指在含有細胞因子的細胞培養(yǎng)液下培養(yǎng)，其中所述的細胞因子包括表皮生長因子、纖維細胞生長因子或其組合； (iii)腫瘤細胞培養(yǎng)上清液復(fù)蘇。5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的可檢測標(biāo)記物包括化學(xué)修飾基團。6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(a)中，從外周血中富集分離循環(huán)腫瘤細胞是通過免疫磁珠法進行分離，其中免疫磁珠上負載有與腫瘤表面抗原特異性結(jié)合的抗體。7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(a)中從外周血樣品中富集分離到的循環(huán)腫瘤細胞CTC的數(shù)量為nl ;而在步驟(b)中，所述微孔陣列芯片的微孔數(shù)量為n2，并且n2/nl的比值彡10。8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(e)中，先清洗去多余的所述葡萄糖類似物，然后根據(jù)被攝取進入循環(huán)腫瘤細胞的所述葡萄糖類似物的信號，表征該循環(huán)腫瘤細胞攝取葡萄糖的能力。9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(b)至(e)中，所述的循環(huán)腫瘤細胞的細胞表面結(jié)合有磁珠。10.一種用于檢測循環(huán)腫瘤細胞代謝活動的裝置，其特征在于，所述裝置包括: (a)魚骨形芯片； (b)微孔陣列芯片； (C)第一容器，以及置于所述第一容器中的帶有可檢測標(biāo)記物的葡萄糖類似物； (d)任選的用于捕獲循環(huán)腫瘤細胞的磁珠，所述磁珠上負載有與腫瘤表面抗原特異性結(jié)合的抗體；和(e)任選的磁場裝置，所述磁場裝置包括永久磁鐵或電磁鐵。
【專利摘要】本發(fā)明提供了循環(huán)腫瘤細胞代謝活動檢測方法和裝置。具體地，本發(fā)明提供了一種檢測循環(huán)腫瘤細胞代謝活動的方法，包括步驟：(a)從外周血樣品中富集分離循環(huán)腫瘤細胞CTC；(b)將循環(huán)腫瘤細胞置于微孔陣列芯片中；(c)對循環(huán)腫瘤細胞進行復(fù)蘇處理；(d)在葡萄糖類似物存在下，培養(yǎng)所述的循環(huán)腫瘤細胞；和(e)檢測所述循環(huán)腫瘤細胞對葡萄糖類似物的攝取情況，從而定性或定量地確定所述循環(huán)腫瘤細胞代謝活動和/或惡性程度。本發(fā)明方法不僅能夠區(qū)分活的CTC與已處于凋亡狀態(tài)的CTC，還能夠識別具有高代謝活性的CTC并計數(shù)，可用于預(yù)測CTC的惡性程度，為后續(xù)有針對性的進行CTC測序提供線索。
【IPC分類】C12Q1/02, C12M1/34, G01N33/569
【公開號】CN105063165
【申請?zhí)枴緾N201510466462
【發(fā)明人】施奇惠, 鄧宇亮, 湯寅
【申請人】上海交通大學(xué)
【公開日】2015年11月18日
【申請日】2015年7月31日