(642)、C-Phycocyanin (648)、T0-PR0?-3 (660)、T0T03 (660)、DiD Di IC (5) (665)、Cy5? (670)、Thiadicarbocyanine (671)、Cy5.5 (694)、HEX (556)、TET (536)、B1search Blue (447)、CAL Fluor Gold 540(544)、CAL Fluor Orange 560 (559)、CAL Fluor Red 590(591)、CAL Fluor Red 610(610)、CAL Fluor Red 635 (637)、FAM(520)、Fluorescein (520)、Fluorescein_C3 (520)、Pulsar650 (566)、Quasar570 (667)，Quasar 670(705)及 Quasar705(610)。括號的數(shù)字為以納米單位表示的最大發(fā)光波長。
[0034]淬滅分子是利用本發(fā)明所屬技術領域中公知的能夠?qū)V范圍波長或特定波長的焚光進行淬滅的非焚光黑淬滅分子，包括黑洞淬滅劑、(BHQ:black hole quencher ;包括BHQ1、BHQ2、BHQ3)、4-[4-( 二甲基氨基)苯偶氮]苯甲酸(DABCYL:4-[4-(Dimethylamino)phenylazo]benzoic acid)。
[0035]引物的FRET標記中，熒光報告分子包含F(xiàn)RET的供體，淬滅分子包含F(xiàn)RET的受體，例如，焚光素染料(fluorescein dye)為報告分子，羅丹明染料(rhodamine dye)為淬滅分子。
[0036]熒光報告分子和淬滅分子均位于引物的錨定序列區(qū)，并且，分別位于缺口劑識別序列的5’ -端和3’ -端的任意位置；或者，焚光報告分子和淬滅分子分別位于銷定序列區(qū)和識別序列區(qū)，并且，分別位于缺口劑識別序列的5’ -端和3’ -端的任意位置。上述標記的共同特征是，由于引物通過其5’-端固定于固相芯片，在反應體系中存在靶分子的條件下，固定于固相芯片的引物因缺口劑在其缺口劑識別序列正義鏈的切割作用而釋放熒光，該熒光因引物的5’-端固定作用而附著在固相芯片，從而可通過固相芯片固定的引物產(chǎn)生的熒光信號判斷檢測體系中存在靶分子，實現(xiàn)靶分子的定性檢測。當反應體系中不存在其固定引物對應的靶分子的條件下，固定于固相芯片的引物不會被缺口劑切割，其熒光報告分子和淬滅分子因FRET作用而不產(chǎn)生熒光信號，此時，其固相芯片也不會檢測到引物產(chǎn)生的可檢測熒光信號，從而判斷檢測體系中不存在靶分子。同時，由于固相芯片固定的引物產(chǎn)生的可檢測熒光信號強度與靶分子的初始豐度正相關，因此，可進一步通過固相芯片固定的引物釋放的熒光強度實現(xiàn)靶分子的定量檢測。
[0037]其工作的原理為:當反應體系中不存在miRNA革El分子時，固定于固相芯片的引物的熒光報告分子和淬滅分子因FRET作用使引物不產(chǎn)生熒光信號；當反應體系中存在miRNA靶分子時，上游引物、下游引物、miRNA靶分子及其所產(chǎn)生的miRNA靶分子互補鏈均能在DNA聚合酶的作用下形成完整的雙鏈核酸分子，從而使切口劑能夠切割固定于固相芯片的上游引物和/或下游引物的缺口劑識別序列正義鏈，此時，固定于固相芯片的熒光報告分子和淬滅分子失去了熒光共振能量轉(zhuǎn)移作用而產(chǎn)生可檢測的熒光信號。當反應體系中固相芯片有多個特定位點時，并且，每種特定位點上固定了靶分子特異性的上游引物和/或下游引物，就能夠在同一個固相芯片同時定性和定量檢測多種靶分子。例如，根據(jù)現(xiàn)有的本發(fā)明所屬技術領域的公知技術，至少可在單個微陣列芯片中同時檢測成百上千種miRNA靶分子。
[0038]如圖1和圖2所示，通過其5’-末端固定于固相芯片的上游引物和/或下游引物包含具有FRET作用的焚光報告分子和淬滅分子，并且，焚光報告分子和淬滅分子分別位于引物錨定序列區(qū)缺口劑識別序列的5’ -端和3’ -端任意位置(圖1)，或者，熒光報告分子和淬滅分子分別位于引物錨定序列區(qū)和識別序列區(qū)，并且，分別位于缺口劑識別序列的5’-端和3’-端任意位置(圖2)。未固定于固相芯片的上游引物和/或下游引物標記不包含F(xiàn)RET作用的熒光報告分子和淬滅分子(圖1、圖2)。當固定于固相芯片的引物被缺口劑切割時，可產(chǎn)生可檢測的熒光信號，并且，由于其5’-端固定于固相芯片，因此，使固相芯片產(chǎn)生可產(chǎn)生的熒光信號，并且，該熒光信號具有靶分子特異性(圖1、圖2)。
[0039]如圖3所示，上游引物Pl和下游引物P2的5’ 一3’堿基序列依次是缺口劑識別序列(nicking agent recognit1n sequences, NARS)正義鏈序列所在的銷定序列區(qū)、特異性識別靶miRNA的識別序列區(qū)。上述引物具有以下三個顯著特點(圖1，2):引物Pl和P2的識別序列區(qū)分別與靶miRNA及其互補鏈(即:miRNA*)的3’-端序列互補，可在缺口酶和DNA聚合酶的協(xié)同作用下分別介導一個既獨立又相互作用的“切割-延伸-鏈置換”線性擴增，最終，二者偶聯(lián)成一個自主鏈式循環(huán)，最終實現(xiàn)靶miRNA的指數(shù)擴增；二者的識別序列區(qū)特定位置均可引入適當數(shù)量的LNA，從而提高擴增溫度(達到55?65°C )，均一化不同GC含量miRNA的Tm值(介于50?55°C )，增強引物-模板單堿基錯配的識別能力；二者可同時固定在固相芯片條件下(圖2)，當引物與模板特異性結(jié)合并延伸成雙鏈核酸分子后，缺口劑的切割將導致引物釋放熒光?；炯夹g原理如圖3所示:革巴miRNA與引物Pl互補結(jié)合，由于成熟miRNA及引物Pl均具有3’ -0H，可彼此延伸成完整雙鏈核酸分子；缺口劑在NARS正義鏈序列切割引物P1，釋放熒光信號，同時，該缺口的5’-端核酸分子，即引物5’-端錨定序列區(qū)所在核酸分子的3’ -端序列因具有3’ -0H,可進一步延伸，并在DNA聚合酶的鏈置換活性作用下，置換出與靶miRNA完全互補的新生DNA鏈(即:miRNA*)，從而形成第一個“切割-延伸-鏈置換”線性擴增；引物Pl釋放的miRNA*又可按照相似原理，觸發(fā)引物P2介導的第二個“切割-延伸-鏈置換”線性擴增，并釋放與靶miRNA序列完全相同的新生DNA鏈(即:miRNA);第一個和第二個線性擴增通過各自釋放的新生DNA鏈彼此偶聯(lián)成一個自主鏈式循環(huán)，并且，每生成一個新生DNA鏈，均會導致一個引物Pl或P2釋放熒光，反應體系釋放的熒光強度與靶miRNA的起始量呈正比關系；當固相芯片的每個特定位點上只固定一種miRNA靶分子對應的上游引物和/或下游引物時，每種miRNA靶分子對應的上游引物和/或下游引物可標記相同的熒光報告分子，此時，每個特定位點只檢測一種miRNA靶分子；或者，當固相芯片的每個特定位點固定兩種或兩種以上miRNA靶分子對應的上游引物和/或下游引物時，在此條件下，每個特定位點固定的每種miRNA靶分子對應的上游引物和/或下游引物標記不同的熒光報告分子，但不同特定位點固定的miRNA靶分子對應的上游引物和/或下游引物可標記相同的熒光報告分子，在此條件下，固相芯片在每個特定位點可檢測兩種或兩種以上不同的miRNA靶分子。由于引物釋放的熒光信號均附著于固相芯片，因此，可通過固相芯片每個特定位點釋放的熒光信號種類和豐度實現(xiàn)多種靶分子的同時檢測。
[0040]固相芯片的每個特定位點只固定miRNA靶分子對應的上游引物(圖4)或下游引物(圖5)。上述兩種案例釋放熒光信號的原理與固相芯片同時固定上游引物和下游引物(圖3)相似，并不影響檢測方法的靈敏度與特異性等方法學參數(shù)。
[0041]進一步，所述的固定于固相芯片的上游引物和/下游引物的錨定序列區(qū)5’-端增加多聚堿基，包括多聚胞腺嘧啶堿基(Poly(Tn))或多聚腺嘌呤堿基(Poly(An)),并通過所述多聚堿基的5’-末端固定于固相芯片。以簡化上述引物固定于固相芯片，并且，能夠最小化對酶作用(如:缺口劑的切割作用)的空間妨礙(space hindrance)，并增加引物與革巴分子的雜交效率，提高恒溫擴增效率。Poly(Tn)或Poly(An)并不影響本發(fā)明所述引物的典型結(jié)構(gòu)及其功能。
[0042]進一步，靶分子特異性上游引物和/或下游引物通過其5’ -末端直接或間接固定于固相芯片，固定的方式包括以共價鍵和非共份鍵的結(jié)合方式固定，或者，通過物理吸附和/或化學耦聯(lián)方式固定，或者，具有胺基的烷基或者芳基化合物作為連接肽固定，或者，具有硫醇基的烷基或者芳基化合物作為連接肽固定引物，或者，通過手臂分子固定。其固定方法包含本發(fā)明所屬技術領域中公知的固定技術，包括通過物理吸附和/或化學耦聯(lián)方式將上游引物和/或下游引物連接于固相芯片，或者，包括具有胺基的烷基或者芳基化合物作為連接肽固定引物，或者，包括具有硫醇基的烷基或者芳基化合物作為連接肽固定引物，或者，包括在固相芯片和/或引物標記、修飾或合成有手臂分子，并通過二者之間的手臂分子、手臂分子與其它分子的相互作用將引物固定于固相芯片。
[0043]進一步，所述多個種類的miRNA靶分子相對應的上游引物和/或下游引物的錨定序列區(qū)、識別序列區(qū)均引入衍生核苷酸，衍生核苷酸包括鎖核酸、肽核酸或硫代修飾堿基。
[0044]進一步，所述多個種類的miRNA靶分子相對應的上游引物和/或下游引物的識別序列區(qū)中含有與miRNA靶分子互補序列3’ -末端倒數(shù)第二位和/或第三位堿基錯配的核苷酸；
[0045]或者，在所述反應混合物中加入可抑制非特異性擴增的生物活性分子，包括TaqMutS、RecA0
[0046]進一步，所述的DNA聚合酶是具有鏈置換活性的DNA聚合酶；或者所述的DNA聚合酶不具有鏈置換活性，且在所述反應混合物中加入具有鏈置換活性的生物活性分子。
[0047]進一步，所述的恒溫的反應溫度范圍為16_70°C。
[0048]進一步，所述的恒溫的反應溫度為37°C、55°C、60°C或65°C。
[0049]進一步，所述的反應時間為10_80min。
[0050]進一步，所述的反應時間為10min、20min、30min、40min、50min 或 60min。
[0051]進一步，本發(fā)明還提供了利用本發(fā)明所述固相芯片實時恒溫指數(shù)擴增方法的檢測試劑或試劑盒，其主要特征及包含的反應成分包括:使用了本發(fā)明所述的上游引物和下游引物；固定了上游引物和/或下游引物的固相芯片；待檢測物是miRNA靶分子或具有3’-OH其它小片段核酸分子，或者，待檢測物是含有miRNA靶分子或具有3’ -OH其它小片段核酸分子的各種生物樣本；DNA聚合酶；識別上游引物和下游引物缺口劑識別序列的缺口劑；三磷酸脫氧核苷酸；滿足上述DNA聚合酶和缺口劑生物學活性功能的離子與緩沖體系；通過檢測固相芯片固定引物釋放的可檢測信號實現(xiàn)多種靶分子的高通量定性和/或定量檢測。
[0052]名詞解釋:
[0053]“衍生核苷酸(derivatized nucleotide) ”是指天然核苷酸之外的其它類型核苷酸。
[0054]“非特異性擴增”是指非靶分子導致的擴增。
[0055]“靶分子”是指采用本發(fā)明所述方法直接或間接檢測的物質(zhì)。
[0056]“寡核苷酸(oligonucleotide, 0DN) ”是指小分子核酸，由核苷酸殘基(片段)通過磷酸二酯鍵(phosphodiester)或其它化學鍵(如:硫代磷酸酯鍵(phosphoroth1ates)連接或聚合而成，分子量介于核酸與核苷酸之間，并傾向于核苷酸。本發(fā)明對核苷酸殘基的數(shù)目并無嚴格界限。
[0057]“新生DNA鏈”是指引物在DNA聚合酶的作用下延伸合成的DNA分子。
[0058]“定性檢測”是指檢測核酸靶分子是否存在，或者檢測靶分子是否存在于待檢測物。
[0059]“定量檢測”是指檢測靶分子的濃度，或者檢測待檢測物中靶分子的濃度，例如，檢測待檢測物中靶分子的拷貝數(shù)。
[0060]“缺口 ”是指雙鏈核酸分子的一條核酸分子鏈保持完整性