，另一條核酸分子鏈的某兩個毗鄰核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷裂，從而形成一個缺口。該缺口兩側(cè)的核酸分子末端分別是3’-OH和5’_P04。
[0061 ] “缺口的5’ -端核酸分子”是指雙鏈核酸分子缺口處帶有3’ -OH的核酸分子鏈。
[0062]“切割(nicking) ”是指切割完全互補雙鏈核酸分子的一條鏈，或者是切割部分雙鏈核酸分子的雙鏈區(qū)域中的一條鏈，并且，切割位置位于NARS的特定位置。核酸分子被切割的特定位置在本發(fā)明中被稱為“缺口位點(nicking site, NS) ”
[0063]“缺口劑識別序列(nicking agent recognit1n sequences, NARS) ” 是指完全或部分雙鏈核酸分子中被缺口劑識別的核苷酸序列。本發(fā)明所述NARS包括NERS和半修飾RERS0
[0064]“缺口內(nèi)切酶識別序列(nicking endonuclease recognit1nsequences, NERS)，，是指完全或部分雙鏈核酸分子中被缺口內(nèi)切酶識別的核苷酸序列。
[0065]“限制性內(nèi)切酶識別序列(restrict1n endonucleaserecognit1nsequences, RERS) ”是指完全或部分雙鏈核酸分子中被限制性切切酶(RE)識別的核苷酸序列。
[0066]“半修飾限制性內(nèi)切酶識別序列(hemimodified RERS) ”是指完全或部分雙鏈核酸分子中一條鏈的RERS序列中至少含有一個衍生核苷酸(如:巰基-脫氧核苷酸(_th1deoxynucleotide)，并且，該衍生核苷酸可阻止能夠識別該RERS的限制性內(nèi)切酶切割含有此衍生核苷酸的鏈(即:在限制性內(nèi)切酶無法切割其識別序列中含有上述衍生核苷酸的核酸分子鏈)，而另一條鏈則在其識別序列的特定位置被切割，從而使限制性內(nèi)切酶具有與缺口內(nèi)切酶一樣的生物學(xué)功能，即:只切割完全或部分雙鏈核酸分子中的一條鏈。
[0067]“缺口劑(nicking agent, NA) ”是指可識別完全或部分雙鏈核酸分子的NARS序列，并且，只在NARS序列雙鏈區(qū)域的缺口位點切割一條核酸分子鏈的內(nèi)切酶。缺口劑包括(但并不限于)缺口內(nèi)切酶(nickingendonuclease, NE ;如:N.BstNBI)、限制性內(nèi)切酶(restrict1nendonuclease, RE ;如:HincII)。對于限制性內(nèi)切酶，只有當完全或部分雙鏈核酸分子含有半修飾RERS時，限制性內(nèi)切酶才被作為缺口劑使用。
[0068]“缺口內(nèi)切酶(nicking endonuclease ;NE) ”是指一種能夠識別完全或部分雙鏈核酸分子的核苷酸序列，并且，只在相對于其識別序列，即NERS的特定位置切割一條核酸分子鏈的內(nèi)切酶。該功能與限制性內(nèi)切酶不同，限制性內(nèi)切酶通常需要在完全或部分雙鏈核酸分子的識別序列中至少有一個衍生核苷酸，該衍生核苷酸能阻止限制性內(nèi)切酶切割含有該衍生核苷酸的核酸分子鏈，而缺口酶通常識別天然核苷酸，并且，只切割完全或部分雙鏈核酸分子中的一條鏈。
[0069]“NARS 正義鏈序列(sequence of the sense strand of the NARS) ” 是指完全或部分雙鏈核酸分子中能夠被缺口劑切割的NARS序列，該序列含有識別該NARS的缺口劑的缺口位點。
[0070]“NARS 反義鏈序列(sequence of the antisense strand of the NARS)，，是指完全或部分雙鏈核酸分子中不能夠被缺口劑切割的NARS序列，該序列沒有識別該NARS的缺口劑的缺口位點。
[0071]“NERS 正義鏈序列(sequence of the sense strand of the NERS)，，是指完全或部分雙鏈核酸分子中能夠被缺口內(nèi)切酶切割的NERS序列，該序列含有識別該NERS的缺口劑的缺口位點。
[0072]“NERS 反義鏈序列(sequence of the antisense strand of the NERS)，，是指完全或部分雙鏈核酸分子中不能夠被缺口內(nèi)切酶切割的NARS序列，該序列沒有識別該NERS的缺口劑的缺口位點。
[0073]“半修飾RERS 正義鏈序列(sequence of the sense strand of the hemimodifiedRERS) ”是指完全或部分雙鏈核酸分子中能夠被限制性內(nèi)切酶切割的RERS序列，該序列含有識別該RERS的缺口劑的缺口位點，其特征是RERS序列均是天然核苷酸。
[0074]“半修飾 RERS 反義鏈序列(sequence of the antisense strand of thehemimodified RERS) ”是指完全或部分雙鏈核酸分子中不能夠被限制性內(nèi)切酶切割的RARS序列，該序列沒有識別該RERS的缺口劑的缺口位點，其特征是RERS序列中至少含有一個衍生核苷酸(如:巰基-脫氧核苷酸，并且，該衍生核苷酸可阻止能夠識別該RERS的限制性內(nèi)切酶切割此序列。
[0075]“恒溫條件(isothermalcondit1ns) ”是指在擴增過程中，反應(yīng)溫度保持基本恒定的反應(yīng)條件(即:溫度相同，或者，最高溫度和最低溫度差異不超過20° C的窄溫度變化范圍)。
[0076]本發(fā)明所述“固定”是指通過物理吸附和/或化學(xué)耦聯(lián)方式將寡核苷酸引物連接于固相芯片。
[0077]本發(fā)明所述“物理吸附”是指寡核苷酸引物通過次級鍵(例如:離子鍵)與固相芯片相連并固定，或者是以非共價鍵作用將寡核苷酸引物直接或恒電位吸附到固相芯片，或者由本發(fā)明引物中的磷酸根負離子與固相芯片帶正電荷的修飾層通過靜電作用而固定。
[0078]本發(fā)明所述“化學(xué)耦聯(lián)”是通過形成共價鍵(例如:酰胺鍵、酯鍵、醚鍵等)使寡核苷酸引物與固相芯片的活性基團相互作用，從而將寡核苷酸引物固定到固相芯片，例如:首先活化預(yù)處理固相芯片，引入各種所需活性基團，如氨基、羧基、巰基、羥基、鹵素基(包括氟、氯、溴、碘等)等，或者衍生核苷酸，使其帶上合適的功能基因，隨后用雙官能試劑或偶聯(lián)活化劑聯(lián)絡(luò)將寡核苷酸引物固定到固相芯片，常用的雙官能基團有戊二醛(GA)、對硝基苯氯甲酸酯(NPC)、馬來酰亞胺(MA)、二異硫氰酸酯等。
【附圖說明】
[0079]下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明技術(shù)方案進一步說明:
[0080]圖1是本發(fā)明所述引物的典型結(jié)果示例圖一；
[0081]圖2是本發(fā)明所述引物的典型結(jié)果示例圖二 ；
[0082]圖3是本發(fā)明使用了固相芯片同時固定了熒光標記上游引物和下游引物的恒溫指數(shù)擴增原理示意圖；
[0083]圖4是本發(fā)明使用了固相芯片只固定了熒光標記上游引物的恒溫指數(shù)擴增原理示意圖；
[0084]圖5是本發(fā)明使用了固相芯片只固定了熒光標記下游引物的恒溫指數(shù)擴增原理示意圖；
[0085]圖6是本發(fā)明的檢測結(jié)果示例。
【具體實施方式】
[0086]在具體實施過程中，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明結(jié)構(gòu)的前提下，還可以作出若干變形和改進，這些也應(yīng)該視為本發(fā)明的保護范圍，這些都不會影響本發(fā)明實施的效果和專利的實用性。
[0087]實施例一:固相芯片的每個特定位點固定一種miRNA革El分子對應(yīng)的上游引物和/或下游引物，在單張固相芯片中同時檢測6種miRNA靶分子
[0088]本發(fā)明僅以6種miRNA靶分子的檢測作為實施例，以說明本發(fā)明的檢測效果。在引物的固相芯片固定方面，為了增加其簡易性，在固定引物的本發(fā)明所述錨定序列區(qū)的5’ -端引入10個連續(xù)的多聚T堿基(Poly (T10))，并通過Poly (T10) 5’ -末端的氨基與固相芯片表面修飾的羧基的化學(xué)耦聯(lián)實現(xiàn)引物在固相芯片的固定。本實施例所采用的化學(xué)耦聯(lián)、固相芯片、固相芯片的熒光檢測均是本發(fā)明所在技術(shù)領(lǐng)域的公知技術(shù)與方法。
[0089]1.靶分子特異性引物的設(shè)計與合成
[0090]SEQ N0.1和SEQ N0.2分別是擴增miRNA靶分子miR-105 (SEQ N0.3)的上游引物和下游引物，SEQ N0.4和SEQ N0.5分別是擴增miRNA靶分子miR_26a(SEQ N0.6)的上游引物和下游引物，SEQ N0.7和SEQ N0.8分別是擴增miRNA革巴分子miR-16 (SEQ N0.9)的上游引物和下游引物，SEQ N0.10和SEQ N0.11分別是擴增miRNA靶分子miR-189 (SEQ N0.12)的上游引物和下游引物，SEQ N0.13和SEQ N0.14分別是擴增miRNA靶分子miR-451 (SEQ N0.15)的上游引物和下游引物，SEQ N0.16和SEQ N0.17分別是擴增miRNA革巴分子miR_7e (SEQN0.18)的上游引物和下游引物。
[0091]各引物5’ 一3’方向的共同序列特征依次是含有Nt.BstNBI切口內(nèi)切酶NERS正義鏈序列(即:5，-GAGTC-3，)的錨定序列區(qū)、特異性識別miRNA靶分子(SEQ N0.3、SEQ N0.6、SEQ N0.9、SEQ N0.12、SEQ N0.15、SEQ N0.18)及其互補鏈的識別序列區(qū)。其中，上游引物和下游引物的序列識別區(qū)分別與miRNA靶分子及其互補鏈的3’ -末端序列互補，并在識別序列區(qū)的部分位置設(shè)計有鎖核酸(LNA ;序列中帶有+號的堿基)。對于固定在固相芯片的引物，包括 SEQ N0.USEQ N0.4、SEQ N0.8、SEQ N0.1USEQ N0.13、SEQ N0.14、SEQ N0.16、SEQ N0.17，均在上述引物的錨定序列區(qū)的5’-末端引入Poly (Tiq)，并在Poly (Tiq)的5’-末端修飾氨基基團。
[0092]上述所有寡核苷酸分子均由專業(yè)公司合成。
[0093]上游引物SEQ N0.1 (5，— 3’ 方向)
[0094]NH2-tttttttttt(FAM)CCGATCTAGTGAGTCtgttctt(BHQl)ACC+AC+A+GG+AG
[0095]下游引物SEQ N0.2(5’ 一 3’ 方向)
[0096]CCGATCTAGTGAGTCtgttcttTC+AA+ATGC+TCA
[0097]miRNA-105 SEQ N0.3 (5，— 3’ 方向)
[0098]UCAAAUGCUCAGACUCC腳G⑶
[0099]上游引物SEQ N0.4(5’ 一 3’ 方向)
[0100](FAM)CCGATCTAGTGAGTCtgttctt(BHQl)AGCC+TA+TCC+TG
[0101]下游引物SEQ N0.5 (5，—3’ 方向)
[0102]CCGATCTAGTGAGTCtgttcttT+TCA+AGT+AAT
[0103]miR-26a SEQ N0.6 (5，— 3，方向)
[0104]UUCAA⑶AAUCCAGGAUAGGCU
[0105]上游引物SEQ N0.7(5’ 一 3’ 方向)
[0106]CCGATCTAGTGAGTCtgttcttCGCC+AA+TA+TT
[0107]下游引物SEQ N0.8(5’ 一 3’ 方向)
[0108]NH2-tttttttttt(FAM)CCGATCTAGTGAGTCtgttctt(BHQl)T+AGC+AGC+ACGT
[0109]miR-16 SEQ N0.9 (5，— 3’ 方向)
[0110]UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG
[0111]上游引物SEQ N0.10(5’ 一3’ 方向)
[0112]CCGATCTAGTGAGTCtgttcttAC+TGA+TA+TCAG
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