一種帕金森的診斷標(biāo)志物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種帕金森的診斷標(biāo)志物及其應(yīng)用，更具體 的涉及FAM102A在制備帕金森診療試劑中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 帕金森?。≒arkinson's disease，PD)是一種慢性進展性疾病，目前無法治愈，它 于1817年被英國人Parkinson首先描述，隨著對的研究進展，我們對這個疾病也有了更 深的了解，它在臨床上表現(xiàn)為運動性癥狀如靜止性震顫、運動遲緩、肌強直和姿勢步態(tài)障礙 及非運動性癥狀如便秘、睡眠障礙、精神行為異常等。目前ro的發(fā)病機制還不清楚，可能與 遺傳因素、線粒體功能缺陷、氧化應(yīng)激、免疫異常、細胞凋亡、環(huán)境因素等有關(guān)。在ro中，約 10%的患者為家族型ro患者，具有明顯的遺傳特性，剩下的90%為散發(fā)性ro患者。現(xiàn)在許 多研究認為，ro是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，而對ro致病基因的研究是目前對 ro發(fā)病機制研究的一大熱點。迄今為止，己經(jīng)發(fā)現(xiàn)與遺傳性ro相關(guān)的基因有SNCA，LRRK2， DJ-1，PINK-1，Parkin等，這些致病基因還需進一步研究，且遠遠不能滿足臨床的需求。對 于ro患者，提前發(fā)現(xiàn)提前制定有針對性的個性化治療方案及最適合患者的療法，從而改善 左旋多巴類藥物的治療狀況和最大限度提高患者的生存質(zhì)量，減輕患者的痛苦、減少家庭 和社會的經(jīng)濟負擔(dān)，這就需要提供更多的分子標(biāo)記以便能及早診斷出帕金森病。
[0003] 為解決目前帕金森分子標(biāo)記稀缺的問題，發(fā)明人對15例帕金森外周血樣本及9例 健康人對照外周血樣本進行高通量測序，結(jié)合生物信息學(xué)方法進行基因篩選，挑選出候選 基因FAM102A。現(xiàn)有的報道表明FAM102A基因和由RSV感染引起的兒科重癥呼吸道合胞病 毒毛細支氣管炎有關(guān)。進一步，本發(fā)明進行了分子生物學(xué)方法證實了 FAM102A與帕金森病 的關(guān)系：FAM102A在帕金森患者外周血中低表達，與帕金森病具有很好的相關(guān)性，可用于制 備帕金森輔助診療制劑，具有重要的臨床應(yīng)用價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供FAM102A基因和/其表達產(chǎn)物在制備帕金森診斷劑中的應(yīng) 用。
[0005] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先通過高通量測序結(jié)合生物信息學(xué)方法篩選到候選基 因FAM102A，進一步通過分子生物學(xué)方法驗證了 FAM102A與帕金森的關(guān)系：FAM102A在帕金 森患者外周血中低表達，與帕金森病具有很好的相關(guān)性，可用于制備治療帕金森制劑和/ 或帕金森診斷制劑，具有重要的臨床應(yīng)用價值。
[0006] 本發(fā)明的目的在于提供FAM102A基因在制備帕金森診斷制劑中的應(yīng)用。
[0007] 進一步，所述的帕金森的診斷制劑包括用熒光定量PCR方法、基因芯片方法檢測 帕金森外周血中FAM102A基因的表達。
[0008] 熒光定量PCR法是通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針，對PCR產(chǎn)物進行標(biāo) 記跟蹤，實時在線監(jiān)控反應(yīng)過程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對產(chǎn)物進行分析，計算待測樣品模板 的初始濃度。熒光定量PCR的出現(xiàn)，極大地簡化了定量檢測的過程，而且真正實現(xiàn)了絕對定 量。多種檢測系統(tǒng)的出現(xiàn)，使實驗的選擇性更強。自動化操作提高了工作效率，反應(yīng)快速、 重復(fù)性好、靈敏度高、特異性強、結(jié)果清晰。
[0009] 基因芯片又稱為DNA微陣列（DNA microarray)，可分為三種主要類型：1)固定在 聚合物基片（尼龍膜，硝酸纖維膜等）表面上的核酸探針或cDNA片段，通常用同位素標(biāo)記 的靶基因與其雜交，通過放射顯影技術(shù)進行檢測。2)用點樣法固定在玻璃板上的DNA探針 陣列，通過與熒光標(biāo)記的靶基因雜交進行檢測。3)在玻璃等硬質(zhì)表面上直接合成的寡核苷 酸探針陣列，與熒光標(biāo)記的靶基因雜交進行檢測?；蛐酒鳛橐环N先進的、大規(guī)模、高通 量檢測技術(shù)，應(yīng)用于疾病的診斷，其優(yōu)點有以下幾個方面：一是高度的靈敏性和準確性；二 是快速簡便；二是可同時檢測多種疾病。
[0010] 所述的用于熒光定量PCR方法檢測帕金森中FAM102A基因的產(chǎn)品含有一對特異性 擴增FAM102A基因的引物；所述的基因芯片包括與FAM102A基因的核酸序列雜交的探針。
[0011] 本發(fā)明的目的在于提供FAM102A基因表達產(chǎn)物在制備帕金森診斷制劑中的應(yīng)用。 進一步，所述的帕金森的診斷制劑包括用免疫方法檢測FAM102A蛋白的表達。優(yōu)選所述免 疫檢測方法檢測帕金森中FAM102A蛋白表達的為western blot和/或ELISA和/膠體金 檢測方法。
[0012] 酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA)即將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使酶標(biāo) 記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面進行的技術(shù)。該技術(shù)可用于檢測大分子抗原和特異性抗體 等，具有快速、靈敏、簡便、載體易于標(biāo)準化等優(yōu)點。ELISA檢測試劑盒根據(jù)檢測目的和操作 步驟可分為間接法、雙抗夾心法、競爭法、雙位點一步法、捕獲法測IgM抗體、應(yīng)用親和素和 生物素的ELISA。ELISA檢測試劑盒中生色底物可選擇辣根過氧化物酶（HRP)或者堿性磷 酸酶（AP)。
[0013] 常用的免疫膠體金檢測技術(shù)：（1)免疫膠體金光鏡染色法細胞懸液涂片或外周血 切片，可用膠體金標(biāo)記的抗體進行染色，也可在膠體金標(biāo)記的基礎(chǔ)上，以銀顯影液增強標(biāo) 記，使被還原的銀原子沉積于已標(biāo)記的金顆粒表面，可明顯增強膠體金標(biāo)記的敏感性。（2) 免疫膠體金電鏡染色法可用膠體金標(biāo)記的抗體或抗抗體與負染病毒樣本或外周血超薄切 片結(jié)合，然后進行負染?？捎糜诓《拘螒B(tài)的觀察和病毒檢測。（3)斑點免疫金滲濾法應(yīng)用微 孔濾膜作載體，先將抗原或抗體點于膜上，封閉后加待檢樣本，洗滌后用膠體金標(biāo)記的抗體 檢測相應(yīng)的抗原或抗體。（4)膠體金免疫層析法將特異性的抗原或抗體以條帶狀固定在膜 上，膠體金標(biāo)記試劑（抗體或單克隆抗體）吸附在結(jié)合墊上，當(dāng)待檢樣本加到試紙條一端的 樣本墊上后，通過毛細作用向前移動，溶解結(jié)合墊上的膠體金標(biāo)記試劑后相互反應(yīng)，當(dāng)移動 至固定的抗原或抗體的區(qū)域時，待檢物與金標(biāo)試劑的結(jié)合物又與之發(fā)生特異性結(jié)合而被截 留，聚集在檢測帶上，可通過肉眼觀察到顯色結(jié)果。該法現(xiàn)已發(fā)展成為診斷試紙條，使用十 分方便。
[0014] 進一步，所述檢測FAM102A蛋白的ELISA法為使用ELISA檢測試劑盒。所述試劑盒 中的抗體可采用市售的FAM102A單克隆抗體，優(yōu)選abeam抗體（Human FAM102A full length protein，貨號abl66482)。進一步，所述的試劑盒包括：包被FAM102A單克隆抗體的固相載 體，酶標(biāo)二抗，酶的底物，蛋白標(biāo)準品，陰性對照品，稀釋液，洗滌液，酶反應(yīng)終止液等。
[0015] 進一步，所述檢測FAM102A蛋白的膠體金法為使用檢測試劑盒，所述的抗體可采 用市售的FAM102A單克隆抗體。進一步，所述的膠體金檢測試劑盒采用膠體金免疫層析技 術(shù)或膠體金滲濾法。進一步，所述的膠體金檢測試劑盒硝酸纖維素膜上的檢測區(qū)（T)噴點 有抗FAM102A單克隆抗體、質(zhì)控區(qū)（C)噴點有免疫球蛋白IgG。
[0016] 本發(fā)明的目的在于提供一種檢測帕金森的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于，所 述試劑盒檢測基因FAM102A，采用特異的上游引物和下游引物，上游引物序列為SEQ ID NO. 1，下游引物序列為SEQ ID NO. 2。
[0017] 進一步，該PCR試劑盒適合于目前存在市場上的所有類型熒光定量基因擴增儀， 靈敏度高，定量快速準確、穩(wěn)定性好，具有良好的應(yīng)用前景。
[0018] 進一步，上述熒光定量PCR試劑盒組分包括：特異性引物、內(nèi)參引物、熒光定量PCR 反應(yīng)液。其中所述的特異性引物包括上游引物和下游引物，上游引物序列為SEQ ID N0. 1， 下游引物序列為SEQ ID N0.2。所述內(nèi)參引物為P-actin內(nèi)參引物，上游引物序列為SEQ ID NO. 3,下游引物序列為SEQ ID NO. 4。
[0019] 所述的試劑盒還包含RNA抽提試劑。優(yōu)選康為世紀血液RNA提取試劑盒進行樣本 RNA提取。
[0020] 本發(fā)明還檢測了本試劑盒靈敏性，結(jié)果顯示本試劑盒檢測范圍為106-10 2C〇pieS/ y 1，最小檢出濃度為lOOcopies/ y 1。
[0021] 本發(fā)明目的是提供了一種帕金森檢測試劑盒，所述的檢測試劑盒檢測FAM102A蛋 白。進一步的，所述的試劑盒還包括其他檢測試劑。
[0022] 本發(fā)明目的是提供了一種檢測帕金森的基因芯片，所述的基因芯片包括與 FAM102A基因的核酸序列雜交的探針。
[0023] 本發(fā)明的目的在于提供一種治療帕金森制劑，所述治療帕金森制劑促進FAM102A 基因的表達。進一步，所述的治療帕金森制劑中含有促進FAM102A基因表達的載體。
[0024] 進一步，所述治療帕金森制劑是指可以促進FAM102A基因的表達的制劑。本領(lǐng)域 人員熟知促進基因的表達通常可以采用下述方法中的一種和/或幾種：通過DNA水平調(diào) 控目的基因：包括但不限于增加FAM102A基因的拷貝數(shù)、轉(zhuǎn)染含F(xiàn)AM102A基因的過表達載 體；通過轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控FAM102A基因：包括但不限于激活FAM102A基因的表達、激活調(diào)控 FAM102A基因表達的啟動子、抑制負調(diào)控FAM102A基因表達的轉(zhuǎn)錄因子、采用RNA干擾技術(shù) 對抑制FAM102A基因表達的抑制子進行干擾；通過轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控FAM102A基因：包括但 不限于抑制促進FAM102A基因mRNA降解的microRNA轉(zhuǎn)錄表達、導(dǎo)入促進FAM102A基因表 達的microRNA ;通過翻譯后水平調(diào)控FAM102A基因：包括但不限于導(dǎo)入促進目的基因編碼 蛋白的分子、抑制負調(diào)控FAM102A基因表達的蛋白、促進FAM102A基因表達的因子及蛋白的 表達。
[0025] RNA干擾（RNAi)是指外源性和內(nèi)源性雙鏈RNA在生物體內(nèi)誘導(dǎo)同源靶基因的 mRNA特異性降解，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后基因沉默的現(xiàn)象，是一種使用小的雙鏈RNA高效、特異地阻斷 體內(nèi)某種特定基因的表達，促使mRNA降解，使細胞表現(xiàn)出特定基因缺失表型的技術(shù)。siRNA 設(shè)計完成后可以采用直接合成法或者構(gòu)建siRNA表達載體，制備好的siRNA可以通過磷酸 ?丐共沉淀法、電穿孔法、DEAE-葡聚糖和polybrene法、顯微注射或基因槍等機械法、陽離子 脂質(zhì)體試劑法等途徑轉(zhuǎn)染細胞。
【附圖說明】
[0026] 圖1 FAM102A基因在帕金森外周血及健康人外周血中相對表達量圖
【具體實施方式】
[0027] 下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本 發(fā)明的限制。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解：在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可 以對這些實施例進行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求及其等同物限 定。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件或按照廠商所建議的條 件實施檢測。
[0028] 實施例1高通量測序及分析
[0029] 樣本來源于北京協(xié)和醫(yī)院，均征得試驗對象知情同意。分別收集15例帕金森病 例外周血樣本及9例健康人對照外周血樣本，進行RNA提取，RNA提取后瓊脂糖凝膠電泳， 從電泳結(jié)果可以初步判定提取的RNA樣品質(zhì)量合格與否，是否可以用于進一步的轉(zhuǎn)錄組分 析。進而通過NanoDroplOOO分光光度計檢測RNA樣品的提取情況，RNA-seq測序的樣品要 求：0D260/0D280 為 1. 8-2. 2。
[0030] 測序平臺為Illumina公司的HiSeq2500高通量測序平臺，進行高通量轉(zhuǎn)錄組深 度測序，測序后我們運用Fast-QC
[0031] (http://www.bioinformatics,babraham.ac.uk/projects/fastqc/)軟件對測 序數(shù)據(jù)的質(zhì)量進行整體評估，包括堿基的質(zhì)量值分布，質(zhì)量值的位置分布，GC含量，PCR dup