lication含量，kmer的frequency等。在差異基因表達(dá)分析時(shí)，根據(jù)得到的FPKM值，采 用國(guó)際公認(rèn)算法EBSeq進(jìn)行差異篩選。其中，篩選時(shí)，L0G2FO1或<-l，F(xiàn)DR〈0.05。為了更 好的理解差異表達(dá)基因的功能，我們對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行了GeneOnlogy和信號(hào)通路分析， 并對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋和蛋白質(zhì)互相作用網(wǎng)絡(luò)分析，鑒于以上數(shù)據(jù)分析的結(jié)果， 結(jié)合文獻(xiàn)我們篩選了差異表達(dá)基因FAM102A。
[0032] 實(shí)施例2帕金森患者外周血及健康人外周血FAM102A基因表達(dá)情況
[0033] 一材料和方法
[0034] 1、材料
[0035] 收集135例帕金森患者外周血及33例健康人外周血，對(duì)其進(jìn)行分組及編號(hào)。
[0036] 2、方法
[0037] 2. 1帕金森患者外周血及健康人外周血總RNA的提取
[0038] 采用康為世紀(jì)血液RNA提取試劑盒（貨號(hào)CW0538)進(jìn)行樣本RNA提取，實(shí)驗(yàn)操作 按產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行，具體操作見(jiàn)說(shuō)明書。
[0039] RNA質(zhì)量判定標(biāo)準(zhǔn)：RNA樣本的0D260/0D280值為1. 7-2. 2之間；總RNA電泳圖譜 有清晰的28S、18S條帶；70°C水浴保溫1小時(shí)后的電泳圖譜與水浴保溫前的圖譜無(wú)明顯差 異。
[0040] 2. 2 FAM102A檢測(cè)引物設(shè)計(jì)與合成
[0041] 根據(jù)PCR引物設(shè)計(jì)原則，應(yīng)用Premier5. 0和增強(qiáng)版的OligoArchitect?軟件進(jìn) 行引物設(shè)計(jì)。
[0042] FAM102A的上、下游引物序列分別為：
[0043] 上游引物：5'-TTCTTGGTCTTGGAACTC-3' ；SEQ ID NO. 1
[0044] 下游引物：5'-GGCACCTTCTAACATTCA-3' ；SEQ ID NO. 2
[0045] 產(chǎn)物長(zhǎng)度為lOlbp。
[0046] 內(nèi)參0 -actin上、下游引物序列分別為：
[0047] 上游引物：5'-AGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3' ；SEQ ID N0. 3
[0048] 下游引物：5'-TCACCTTCACCGTTCCAGTTT-3' ；SEQ ID NO. 4
[0049] 產(chǎn)物長(zhǎng)度為150bp。
[0050] 2. 3定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
[0051] 標(biāo)準(zhǔn)DNA模板的制備
[0052] 按照說(shuō)明書，從外周血中利用康為世紀(jì)血液RNA提取試劑盒（貨號(hào)CW0538)提取 總RNA，接著用康為世紀(jì)SuperRT cDNA第一鏈合成試劑盒（貨號(hào)CW0741)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)， 具體步驟如下：
[0053] 1?將 RNA 模板、Primer Mix、dNTP Mix、RT Buffer、SuperRT 和 RNase-Free Water 溶解并置于冰上備用。
[0054] 2.配置反應(yīng)體系，總體積為20 y 1 :終濃度為50pg-5 y g的RNA模板、2 y 1 Primer Mix、4yl dNTP Mix、4 yl RT Buffer、lylSuperRT，加 RNase-Free Water 補(bǔ)平到 20 yl〇
[0055] 3.渦旋震蕩混勻，短暫離心，使管壁上的溶液收集到管底。
[0056] 4. 42°C孵育30-50分鐘，85°C孵育5分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，短暫離心，置于冰上冷卻。
[0057] 將逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到的cDNA用康為世紀(jì)2XTaq MasterMix (貨號(hào)CW0682)進(jìn)行常 規(guī)PCR，反應(yīng)體系和條件如下：2XTaq MasterMix 25yl、上下游引物各2yl、cDNA0.5yg、 補(bǔ)平至50yl。反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性2min ;94°C變性30s，50°C退火30s，72°C延伸30s， 30cycles ;最后 72°C延伸 2min。
[0058] 取樣5 y L，對(duì)PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，進(jìn)行切膠回收并純化， 將純化產(chǎn)物連接到pGM-T克隆載體，隨后轉(zhuǎn)化到DH5 a感受態(tài)細(xì)胞中。通過(guò)序列為SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0. 2的特異性引物篩選陽(yáng)性克隆。陽(yáng)性克隆擴(kuò)增后提取質(zhì)粒DNA，質(zhì) 粒 DNA 米用 NanoDrop ND-1000 核酸定量?jī)x定量（NanoDrop Technologies，Wilmington， Delaware)并做10倍系列稀釋作為標(biāo)準(zhǔn)品用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備（標(biāo)準(zhǔn)DNA模板濃度范圍在 108_102copies/y1)〇
[0059] 2. 3敏感性實(shí)驗(yàn)
[0060] 取重組質(zhì)粒按比例稀釋為108、107、106、10 5、104、103、102個(gè)拷貝/1^，進(jìn)行熒光定 量PCR，以檢測(cè)為陽(yáng)性的最低濃度為該方法的檢測(cè)靈敏度。本研究所建立的方法檢測(cè)范圍為 10 8_102copies/iiL，最小檢出濃度為 lOOcopies/yL。
[0061] 2. 4 qRT-PCR 檢測(cè) FAM102A 基因表達(dá)量
[0062] 取上述135例帕金森患者外周血和33例健康人外周血用康為世紀(jì)血液RNA提取 試劑盒（貨號(hào)CW0538)提取總RNA，進(jìn)而用UltraSYBR -步法熒光定量PCR試劑盒（貨號(hào) CW0660)進(jìn)行RT-PCR。具體步驟：
[0063]1?將 RNA 模板、引物、2 X UltraSYBR One St印 RT-qPCR Buffer (With R0X)、 SuperEnzyme Mix和RNase-Free Water溶解并置于冰上備用。
[0064]2.RT-PCR 反應(yīng)體系（25yl) :2X UltraSYBR One St印 RT-qPCR Buffer (With ROX) 12. 5 y 1、上游引物（10 yM)0. 5 y 1、下游引物（10 yM)0. 5 y 1、SuperEnzyme Mix 0? 5 y 1、加 RNA 模板（終濃度為 lOpg - lOOng)、RNase-Free Water 補(bǔ)平至 25 y l〇 [0065] 3.渦旋震蕩混勻，短暫離心，將溶液收集到管底。
[0066] 4.將熱循環(huán)儀預(yù)熱到45°C，將PCR管置于熱循環(huán)儀中，按以下反應(yīng)條件進(jìn)行反應(yīng)： 反轉(zhuǎn)錄：45°C 10min ;95°C 10min 預(yù)變性，接 45 個(gè)循環(huán)：95°C 15s，60°C 60s。
[0067] 對(duì)qRT-PCR反應(yīng)結(jié)果使用SPSS For Windows 11. 5軟件，相關(guān)數(shù)據(jù)采用x 2檢驗(yàn) 和Fisher確切概率法進(jìn)行處理，P < 0. 05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；qRT-PCR反應(yīng)利用MedCalc統(tǒng)計(jì) 分析軟件來(lái)計(jì)算。
[0068] 二結(jié)果
[0069] 實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增曲線拐點(diǎn)清楚，擴(kuò)增曲線整體平行性好，表明各反應(yīng)管的擴(kuò)增 效率相近，極限平而無(wú)上揚(yáng)現(xiàn)在，曲線指數(shù)期斜率較大，說(shuō)明擴(kuò)增效率較高；樣本擴(kuò)增產(chǎn)物 溶解曲線都是單峰，說(shuō)明擴(kuò)增產(chǎn)物只有一條，為特異性擴(kuò)增；根據(jù)qRT-PCR的相對(duì)定量公 式：2_ACtX100%，比較FAM102A基因在帕金森外周血和健康人外周血中的表達(dá)水平。結(jié) 果顯示（具體見(jiàn)圖1) :qRT_PCR擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定，其中FAM102A在帕金森患者外周血中的表達(dá) 水平低于健康人外周血，
[0070] 以上結(jié)果驗(yàn)證了高通量轉(zhuǎn)錄組表達(dá)數(shù)據(jù)的整合分析FAM102A在帕金森外周血中 低表達(dá)的結(jié)果。
[0071] 實(shí)施例3 -種檢測(cè)帕金森的檢測(cè)試劑盒及使用方法
[0072] RNA提取試劑：超純RNA提取試劑盒（貨號(hào)CW0597)
[0073] 熒光定量試劑：UltraSYBR -步法熒光定量PCR試劑盒（貨號(hào)CW0660)
[0074]
[0076] 熒光定量PCR反應(yīng)體系及方法：
[0077] RT-PCR 反應(yīng)體系（邪 y 1) JXUltraSYBR One St印 RT-qPCR Buffer(With R0X) 12. 5 y 1、上游引物（10 yM)0. 5 y 1、下游引物（10 yM)0. 5 y 1、SuperEnzyme Mix 0? 5 y 1、加 RNA 模板（終濃度為 lOpg - lOOng)、RNase-Free Water 補(bǔ)平至 25 y l〇
[0078] 反應(yīng)調(diào)節(jié)：反轉(zhuǎn)錄：45°C lOmin ;95°C lOmin預(yù)變性，接30-40個(gè)循環(huán)：95°C 15s， 60°C 60s〇
[0079] 本發(fā)明采用高通量測(cè)序篩選出帕金森致病相關(guān)基因FAM102A，結(jié)合分子生物學(xué)實(shí) 驗(yàn)驗(yàn)證，證實(shí)了 FAM102A在帕金森疾病中具有重要的作用。本發(fā)明為帕金森臨床診療提供 了新的靶標(biāo)，具有很好的臨床應(yīng)用前景。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. FAM102A基因和/或其表達(dá)產(chǎn)物在制備帕金森診斷制劑中的應(yīng)用。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的帕金森的診斷制劑包括用熒光定 量PCR方法、基因芯片方法檢測(cè)FAM102A基因的表達(dá)。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的用于熒光定量PCR方法檢測(cè) FAM102A基因的產(chǎn)品含有一對(duì)特異性擴(kuò)增FAM102A基因的引物；所述的基因芯片包括與 FAM102A基因的核酸序列雜交的探針。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的帕金森的診斷制劑包括用免疫方 法檢測(cè)FAM102A蛋白的表達(dá)。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述免疫方法檢測(cè)FAM102A蛋白表達(dá)的為 ELISA檢測(cè)試劑盒和/膠體金檢測(cè)試劑盒。6. -種檢測(cè)帕金森的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于，所述試劑盒檢測(cè)基因 FAM102A，采用特異的上游引物和下游引物，上游引物序列為SEQ ID NO. 1，下游引物序列為 SEQ ID NO. 2。 7. FAM102A基因和/或其表達(dá)產(chǎn)物在制備帕金森治療制劑中的應(yīng)用。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述帕金森治療制劑可以采用下述方法 中的一種和/或幾種促進(jìn)FAM102A基因的表達(dá)：包括增加FAM102A基因的拷貝數(shù)、轉(zhuǎn)染含 FAM102A基因的過(guò)表達(dá)載體；激活FAM102A基因的表達(dá)、激活調(diào)控FAM102A基因表達(dá)的啟動(dòng) 子、抑制負(fù)調(diào)控FAM102A基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子、采用RNA干擾技術(shù)對(duì)抑制FAM102A基因表 達(dá)的抑制子進(jìn)行干擾；抑制促進(jìn)FAM102A基因mRNA降解的microRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)、導(dǎo)入促進(jìn) FAM102A基因表達(dá)的microRNA ;導(dǎo)入促進(jìn)目的基因編碼蛋白的分子、抑制負(fù)調(diào)控FAM102A基 因表達(dá)的蛋白、促進(jìn)FAM102A基因表達(dá)的因子及蛋白的表達(dá)。9. 一種治療帕金森制劑，其特征在于，所述治療帕金森制劑促進(jìn)FAM102A基因的表達(dá)。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的治療帕金森制劑，其特征在于，所述的治療帕金森制劑中含 有促進(jìn)FAM102A基因表達(dá)的載體。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種帕金森的診斷標(biāo)志物及其應(yīng)用，更具體的涉及FAM102A在制備帕金森診療試劑中的應(yīng)用。發(fā)明人基于高通量測(cè)序結(jié)果采用生物信息學(xué)方法分析進(jìn)行基因篩選，挑選出候選基因FAM102A，進(jìn)一步，通過(guò)分子生物學(xué)方法證實(shí)了FAM102A基因與帕金森病的關(guān)系：FAM102A基因在帕金森患者外周血中低表達(dá)，與帕金森病具有很好的相關(guān)性，可用于制備帕金森病輔助診療制劑，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。
【IPC分類】A61K48/00, A61K45/00, A61K31/713, C12Q1/68, A61P25/16, G01N33/68
【公開(kāi)號(hào)】CN105063194
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510464905
【發(fā)明人】楊承剛, 肖楓
【申請(qǐng)人】北京泱深生物信息技術(shù)有限公司
【公開(kāi)日】2015年11月18日
【申請(qǐng)日】2015年7月31日