外，芳酸酯V吸收峰明顯出現(xiàn)在 1731. 58cm1處，鄰苯二甲酸酯的伸縮振動(dòng)的雙帶出現(xiàn)在1288. 00, 1129. 98cm 1處；芳核的 V吸收帶出現(xiàn)在1589. 43, 1537. 81cm 1處，上述波峰充分說(shuō)明反應(yīng)產(chǎn)物4-硝基鄰苯二 甲酸二丁酯中具備苯環(huán)、丁氧基、硝基基官能團(tuán)的結(jié)構(gòu)特征。
[0064] 實(shí)施例5、鄰苯二甲酸二丁醅半抗原的制備
[0065] 稱(chēng)取I. 5g(0. 0046mol)DBP半抗原中間體（4-硝基鄰苯二甲酸二丁酯）裝入容積 為500mL三口圓底燒瓶底部，隨后向瓶底邊攪拌邊加入230mL (2. 5871mol)苯，待4-硝基鄰 苯二甲酸二丁酯被苯溶解后再加入2. 80g(0. 0428mol)純鋅粉，攪拌均勻后分次加入8. 2mL 濃HCl (0. 0984mol)，室溫?cái)嚢?5min后再次加入2. 80g (0. 0428mol)純鋅粉，室溫?cái)嚢璺磻?yīng) 12h，薄板層析法（TLC)監(jiān)測(cè)反應(yīng)直至反應(yīng)完全；反應(yīng)結(jié)束后，將280mL冷水加入反應(yīng)體系， 并用IM NaOH溶液中和至弱堿性（pH 7. 0-8.5);靜置Ih后分離并保留苯層，再用苯萃取水 層，合并萃取液，有機(jī)相經(jīng)水洗后用無(wú)水Na2SOJ^水干燥以除去多余的水分；有機(jī)相減壓蒸 餾以除去苯，得到的粗品再用硅膠柱層析（洗脫劑為乙酸和正己烷的混合液（V/V= 1:10)) 后減壓蒸餾，得到淡黃色晶體4-氨基鄰苯二甲酸二丁酯即DBP半抗原。鄰苯二甲酸二丁酯 半抗原分子式=C 16H23NO4;分子量293. 35 ;產(chǎn)率89. 8% ;熔點(diǎn)：68~69°C，純度99%。
[0066] 實(shí)施例6、鄰苯二甲酸二丁醅半抗原的制備
[0067] 稱(chēng)取I. 5g(0. 0046mol)DBP半抗原中間體（4-硝基鄰苯二甲酸二丁酯）裝入容積 為500mL三口圓底燒瓶底部，隨后向瓶底邊攪拌邊加入229mL (2. 5760mol)苯，待4-硝基鄰 苯二甲酸二丁酯被苯溶解后再加入2. 71g(0. 0414mol)純鋅粉，攪拌均勾后分次加入8. ImL 濃HCl (0. 0966mol)，30°C攪拌15min后再次加入2. 71g (0. 0414mol)純鋅粉，室溫?cái)嚢璺磻?yīng) l〇h，薄板層析法（TLC)監(jiān)測(cè)反應(yīng)直至反應(yīng)完全；反應(yīng)結(jié)束后，將271mL冷水加入反應(yīng)體系， 并用IM NaOH溶液中和至弱堿性（pH 7. 0-8.5);靜置Ih后分離并保留苯層，再用苯萃取水 層，合并萃取液，有機(jī)相經(jīng)水洗后用無(wú)水Na2SOJ^水干燥以除去多余的水分；有機(jī)相減壓蒸 餾以除去苯，得到的粗品再用硅膠柱層析（洗脫劑為乙酸和正己烷的混合液（V/V= 1:10)) 后減壓蒸餾，得到淡黃色晶體4-氨基鄰苯二甲酸二丁酯即DBP半抗原。鄰苯二甲酸二丁酯 半抗原分子式=C16H 23NO4;分子量293. 35 ;產(chǎn)率90. 2% ;熔點(diǎn)：68~69°C，純度99%。
[0068] 實(shí)施例7、鄰苯二甲酸二丁醅半抗原的制備
[0069] 稱(chēng)取I. 5g(0. 0046mol)DBP半抗原中間體（4-硝基鄰苯二甲酸二丁酯）裝入容積 為500mL三口圓底燒瓶底部，隨后向瓶底邊攪拌邊加入234mL (2. 6220mol)苯，待4-硝基鄰 苯二甲酸二丁酯被苯溶解后再加入2. 86g(0. 0437mol)純鋅粉，攪拌均勻后分次加入8. 4mL 濃HCl (0? 1012mol)，室溫?cái)嚢?5min后再次加入2. 86g (0? 0437mol)純鋅粉，室溫?cái)嚢璺磻?yīng) llh，薄板層析法（TLC)監(jiān)測(cè)反應(yīng)直至反應(yīng)完全；反應(yīng)結(jié)束后，將286mL冷水加入反應(yīng)體系， 并用IM NaOH溶液中和至弱堿性（pH 7. 0-8.5);靜置Ih后分離并保留苯層，再用苯萃取水 層，合并萃取液，有機(jī)相經(jīng)水洗后用無(wú)水Na2SOJ^水干燥以除去多余的水分；有機(jī)相減壓蒸 餾以除去苯，得到的粗品再用硅膠柱層析（洗脫劑為乙酸和正己烷的混合液（V/V= 1:10)) 后減壓蒸餾，得到淡黃色晶體4-氨基鄰苯二甲酸二丁酯即DBP半抗原。鄰苯二甲酸二丁酯 半抗原分子式=C 16H23NO4;分子量293. 35 ;產(chǎn)率90. 3% ;熔點(diǎn)：68~69°C，純度99%。
[0070] 實(shí)施例8、鄰苯二甲酸二丁醅半抗原的表征
[0071] 獲得的DBP半抗原，其結(jié)構(gòu)通過(guò)核磁共振、紅外光譜、紫外光譜等檢 測(cè)手段分析鑒定，DBP半抗原的紅外光譜如圖2所示，其特征如下=IR(KBr) V /cm h 3451. 79, 3362. 77 (-NH2)，1716. 12 (C = 0)，1290. 51，1142. 57 (C-O-C)， 2956. 59, 2871. 60 (-CH3)，1458. 28 (d-0CH2-)，1602. 04, 1565. 54, 1476. 69 (C = C)， 1682. 88, 850. 77 (C-H，Ar)。分析結(jié)果可知，4-氨基鄰苯二甲酸二丁酯的伯胺的N-H鍵 的不對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)（V as N H)和對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)（V s N H)的吸收帶分別出現(xiàn)在3451. 79和 3362. 77cm1附近，這已證實(shí)硝基已經(jīng)被還原成氨基；此外，芳酸酯V。=。吸收峰明顯出現(xiàn)在 1716. 12cm1處，鄰苯二甲酸酯的伸縮振動(dòng)的雙帶分別出現(xiàn)在1290. 51，1142. 57cm 1處；芳核 的V c = c吸收帶出現(xiàn)在1602. 07,1565. 54,1476. 69cm 1處。總體來(lái)看，上述波峰充分說(shuō)明了 反應(yīng)產(chǎn)物中具備苯環(huán)、丁氧基、氨基官能團(tuán)的結(jié)構(gòu)特征。
[0072] DBP半抗原的核磁共振氫譜圖如圖3所示，其特征如下NMR(400MHz，⑶Cl3): 8 7. 71 (d, IH1ArH),1.24 (d, IH1ArH) ,6. 96 (d, IH1ArH) ,4. 28(t,2H, OCH2) ,4. 24 (t, 2H，OCH2)，4. 22 (b，2H，-NH2)，1. 69-1. 64 (m，4H，OCH2CH2)，1. 43-1. 38 (m，4H，OCH2CH2CH2)， 0? 93(t，6H，0CH2CH2CH2CH3)ppm。從中可明顯看出：苯環(huán)上引入氨基偶聯(lián)臂后，S 4. 17處出現(xiàn) 氨基氫，波譜圖中出現(xiàn)的氫原子的位置和個(gè)數(shù)與所合成的半抗原4-氨基鄰苯二甲酸二丁 酯結(jié)構(gòu)相符。
[0073] 實(shí)施例9、鄰苯二甲酸二丁醅人工全抗原的制備
[0074] 本發(fā)明制備的鄰苯二甲酸二丁酯半抗原，主要應(yīng)用在環(huán)境中鄰苯二甲酸二丁酯的 免疫檢測(cè)中。它的主要用途之一，就是可以用來(lái)直接和蛋白質(zhì)大分子偶聯(lián)，制備出用來(lái)免疫 動(dòng)物的免疫原，進(jìn)而制備出相應(yīng)的單克隆或多克隆抗體。在此基礎(chǔ)上建立鄰苯二甲酸二丁 酯的免疫測(cè)定方法。下面就鄰苯二甲酸二丁酯半抗原的使用做以下應(yīng)用舉例：
[0075]采用重氮化法制備DBP免疫原DBP-BSA，具體合成步驟：將0. 0294g (0.1 mM) DBP半 抗原用lOOyLN，N-二甲基甲酰胺（DMF)溶解，然后在不斷攪拌的情況下逐滴加入到裝有 40 y L濃鹽酸和900 y L DMF的混合液的25mL錐形瓶中，待混合物加熱溶解后置冰浴中冷 卻；隨后，在4°C低溫?cái)嚢璧那闆r下，逐滴滴加IM亞硝酸鈉溶液，用pH試紙控制反應(yīng)酸度為 2. 0-3. 0,同時(shí)用淀粉碘化鉀試紙顯色，顯色時(shí)間為滴加后的l-3s，試紙由白色瞬間變成灰 藍(lán)色時(shí)停止滴加，再繼續(xù)反應(yīng)60min，加1.0 g尿素以去除未反應(yīng)的亞硝酸鈉；然后，在4°C 低溫?cái)嚢璧那闆r下，將上述重氮鹽逐滴加入到0.08mM BSA溶液（0.0 lM pH 9. 18硼酸鈉緩 沖液溶解）IOmL中，溶液用IM氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH直至逐漸呈橙紅色，繼續(xù)反應(yīng)12h后， 將得到的抗原粗品裝入透析袋，置于〇. OlM pH7. 40磷酸鹽緩沖液中透析3d，每隔8h換水1 次，最后將終產(chǎn)物4000r ? min 1離線lOmin，取其上清液即DBP免疫原DBP-BSA。免疫原經(jīng) 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)鑒定后，小量分裝，_20°C冷凍干燥、分裝并于-20°C保存。
[0076] 通過(guò)戊二醛法制備DBP包被原DBP-OVA，具體合成步驟：0? 0294g (0? ImM) DBP半抗 原裝入容積為25mL的錐形瓶中，邊滴加lmLN，N-二甲基甲酰胺（DMF)邊攪拌，攪拌均勻后 再逐滴加入到0. 08mM OVA溶液（0.0 lM pH 7. 40磷酸鹽緩沖液溶解）IOmL中，隨后向該混 合體系中緩慢加入〇. 〇38mL 25%戊二醛，4°C低溫閉光攪拌反應(yīng)32h后，將得到的抗原粗品 裝入透析袋，置于0.0 lM pH 7. 40磷酸鹽緩沖液中低溫4°C透析3d，每隔8h換水1次，最后 將終產(chǎn)物4000r ^min 1離線lOmin，