取其上清液即DBP包被原DBP-OVA。包被原經(jīng)紫外-可 見(jiàn)分光光度計(jì)鑒定后，冷凍干燥、小量分裝，_20°C冷凍保存。
[0077] 偶聯(lián)物經(jīng)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)掃描鑒定后，從圖4和圖5的DBP半抗原、載體蛋 白和人工全抗原紫外光譜圖中可以看出，DBP半抗原有兩個(gè)紫外吸收峰即281nm和308nm， 其中308nm處紫外吸收峰為特征峰；BSA有兩個(gè)紫外吸收峰，分別位于227nm和278nm處， 其中278nm紫外吸收峰處的吸收值很低；OVA有三個(gè)紫外吸收峰，分別位于234、241nm和 268nm處，其中279nm紫外吸收峰處的吸收值較低。偶聯(lián)物DBP-BSA兩個(gè)紫外吸收峰，分別 位于228nm和334nm處；DBP-OVA有兩個(gè)紫外吸收峰，分別位于228nm和372nm處；此外，我 們可以清晰發(fā)現(xiàn)，DBP-BSA和DBP-OVA紫外光譜中不僅分別包含BSA和OVA的特征峰，還在 336和360nm處出現(xiàn)了新的吸收峰。DBP-BSA和DBP-OVA半抗原特征吸收峰發(fā)生了紅移，這 可能是受到載體蛋白的吸收峰的影響所致。吸收峰紅移現(xiàn)象的出現(xiàn)，以上信息表明DBP-BSA 和DBP-OVA偶聯(lián)成功。
[0078] 這些全抗原既可以用于免疫動(dòng)物，通過(guò)動(dòng)物產(chǎn)生的免疫反應(yīng)得到可以用來(lái)做免疫 分析的單克隆或多克隆抗體，又可以作為免疫競(jìng)爭(zhēng)對(duì)象而使用。
[0079] 實(shí)施例10、鄰苯二甲酸二丁醅多克降抗體的制備
[0080] 為證實(shí)DBP半抗原偶聯(lián)合成的人工免疫原DBP-BSA具有免疫原性，故通過(guò)生物體 免疫反應(yīng)制備抗DBP多克隆抗體，具體如下：選擇2只成年健康雄性新西蘭白兔，合成出的 人工免疫原DBP-BSA經(jīng)過(guò)與弗氏完全佐劑充分混合后，對(duì)大白兔進(jìn)行頸部和背部點(diǎn)狀注射 免疫，經(jīng)過(guò)7次加強(qiáng)免疫后，采用間接酶聯(lián)免疫分析法測(cè)定抗血清效價(jià)，其抗血清效價(jià)均已 達(dá)到180000。試驗(yàn)顯示交叉反應(yīng)均不明顯，說(shuō)明其特異性較好。
[0081] 實(shí)施例11、間接競(jìng)爭(zhēng)BA-ELISA免痔分析方法檢測(cè)環(huán)境樣品中鄰苯二甲酸二丁醅
[0082] 為了證明DBP人工包被原DBP-OVA制備成功，通過(guò)與DBP標(biāo)準(zhǔn)溶液競(jìng)爭(zhēng)與DBP人 工免疫原DBP-BSA免疫動(dòng)物制備得到的抗DBP多克隆抗體之間的特異性識(shí)別反應(yīng)，進(jìn)而 建立間接競(jìng)爭(zhēng)BA-ELISA免疫分析方法檢測(cè)環(huán)境中的DBP，具體步驟如下：用用包被緩沖液 (0? 05M pH 9. 60碳酸鹽緩沖液）適當(dāng)稀釋包被原溶液（DBP-OVA)，100 y L/孔，加入96孔 酶標(biāo)板中，4°C包被過(guò)夜；次日倒掉包被液，每孔加入200 y L洗滌液（0.0 lM pH 7. 40PBST)， 重復(fù)洗滌三次，每次3min ;用吸水紙拍干酶標(biāo)板后，每孔加入封閉液200 y L，37°C溫育1小 時(shí)；倒掉封閉液，重復(fù)上述洗滌過(guò)程三次，生物素化抗DBP多克隆抗體（Bio-pAb-DBP)稀釋 至適當(dāng)濃度，每孔依次加入50 yL生物素化抗體及50 yL DBP標(biāo)準(zhǔn)樣品（用含5%二甲亞砜 (DMSO)的PBS (v/v)梯度稀釋?zhuān)?，空白孔每孔加?00 y L PBS緩沖液，37°C溫育30分鐘；倒 掉抗原_抗體反應(yīng)液，重復(fù)洗滌三次，用PBST適當(dāng)稀釋辣根過(guò)氧化酶（HRP)標(biāo)記的鏈霉親 和素（HRP-SA)，每孔加入100 y L，37°C溫育1小時(shí)；倒掉HRP-SA溶液，重復(fù)洗滌五次，每孔 加入新鮮配制的顯色液（400 y L 2. 5mg/mL 3, 3'，5, 5' -四甲基聯(lián)苯胺底物溶液與IOmL磷 酸鹽-檸檬酸底物緩沖液、10 y L 30 %的H2O2混合形成顯色液）100 y L/孔，室溫下避光反 應(yīng)15min ;每孔加入50 y L終止液（2mol/L硫酸溶液）以終止顯色，然后用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔 在450nm和630nm處吸光度值（0D值），以O(shè)D = OD45q-OD63q作為最終讀數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用抑 制率來(lái)表示，并以抑制率為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，建立的 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)如圖6所示。其中，抑制率（％ ) = (1-A/A。）X100,其中A為有樣品存在的 孔的OD值，A。為沒(méi)有樣品存在的孔的OD值。
[0083] 生物素化抗體的制備如下：用0. 05M pH 9. 60碳酸鹽緩沖液將純化后的抗DBP多 克隆抗體稀釋至1.0 mg/mL左右，取2mL加入錐形瓶中；用DMSO配制1.0 mg/mL生物素-N-琥 珀酰亞胺基酯（BNHS)溶液，向上述錐形瓶中加入BNHS溶液，使BNHS :抗DBP多克隆抗體 的質(zhì)量比為1 :1〇,室溫下攪拌反應(yīng)4小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液裝入透析袋中，用PBS緩 沖液透析3d，每天換水3次。離心分離去除少量沉淀后，即得相應(yīng)的生物素化抗體溶液 (Bio-pAb-DBP)，抗體溶液小體積分裝后，于-20°C冷凍保存。
[0084] 間接競(jìng)爭(zhēng)BA-ELISA免疫分析方法檢測(cè)鄰苯二甲酸二丁酯的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)如圖6 所示，其標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為Y = 21.39LgCDBP+59. 52,相關(guān)系數(shù)R2= 0.9815,其中IC5。表示檢 測(cè)方法的靈敏度，即抑制率為50%時(shí)對(duì)應(yīng)的分析物濃度0. 361 y g/L JC1。表示方法的檢 測(cè)下限，即抑制率為1〇%時(shí)對(duì)應(yīng)的分析物濃度〇.〇〇53 118/1;1(：2。-1(：8。表示線(xiàn)性范圍，即 0? 015 y g/L ~8. 965 y g/L。
[0085] 以上對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了描述。需要理解的是，本發(fā)明并不局限于上述 特定實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在權(quán)利要求的范圍內(nèi)做出各種變形或修改，這并不影 響本發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)容。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種鄰苯二甲酸二丁酯半抗原，其特征在于，其結(jié)構(gòu)式如式（I)所示：2. -種如權(quán)利要求1所述的鄰苯二甲酸二丁酯半抗原的制備方法，其特征在于，所述 方法包括如下步驟： 51、 4-硝基鄰苯二甲酸與正丁醇在強(qiáng)酸A的催化下回流反 應(yīng)，生成4-硝基鄰苯二甲酸二丁酯； 52、 以非質(zhì)子性有機(jī)溶劑為溶劑，4-硝基鄰苯二甲酸二丁酯和鋅粉、強(qiáng)酸B發(fā)生還原反 應(yīng)，生成所述鄰苯二甲酸二丁酯半抗原。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的鄰苯二甲酸二丁酯半抗原的制備方法，其特征在于，所述 4-硝基鄰苯二甲酸、正丁醇、強(qiáng)酸A的摩爾比為1:6~7:0. 5~0. 7 ;所述4-硝基鄰苯二甲 酸二丁酯、強(qiáng)酸B、非質(zhì)子性有機(jī)溶劑和鋅粉的摩爾比為1:21~22:560~570:18~19。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的鄰苯二甲酸二丁酯半抗原的制備方法，其特征在于，步驟S1 中，所述回流反應(yīng)的溫度為120~130°C，反應(yīng)時(shí)間為6~6. 5小時(shí)；步驟S2中，所述還原 反應(yīng)的溫度為25~30°C，反應(yīng)時(shí)間為10~12小時(shí)。5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的鄰苯二甲酸二丁酯半抗原的制備方法，其特征在于，所述強(qiáng) 酸A選自濃硫酸或濃鹽酸；所述強(qiáng)酸B選自濃硫酸或濃鹽酸。6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的鄰苯二甲酸二丁酯半抗原的制備方法，其特征在于，步驟S2 中的非質(zhì)子性有機(jī)溶劑選自苯或甲苯。7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的鄰苯二甲酸二丁酯半抗原的制備方法，其特征在于，步驟S1 還包括回流反應(yīng)結(jié)束后蒸餾除去未反應(yīng)的正丁醇和生成的水；此時(shí)將液體趁熱倒入冰水 中，析出固體；過(guò)濾后得到的固體粗品用10%Na2C(V^液洗滌至水層呈無(wú)色，固體粗品用無(wú) 水正丁醇重結(jié)晶，得到純化后的4-硝基鄰苯二甲酸二丁酯的步驟。8. -種鄰苯二甲酸二丁酯半抗原中間體，其特征在于，其結(jié)構(gòu)式如式（II)所示：9. 一種鄰苯二甲酸二丁酯人工全抗原，其特征在于，所述人工全抗原是由如權(quán)利要求 1所述的鄰苯二甲酸二丁酯半抗原通過(guò)戊二醛法或重氮化法或碳二亞胺法與蛋白質(zhì)分子偶 聯(lián)制備而得。10. -種如權(quán)利要求1所述的鄰苯二甲酸二丁酯半抗原在用于痕量塑化劑鄰苯二甲酸 二丁酯檢測(cè)中的用途。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種鄰苯二甲酸二丁酯半抗原及其制備方法和用途；所述鄰苯二甲酸二丁酯半抗原的結(jié)構(gòu)式為：其制備方法為以4-硝基鄰苯二甲酸為原料，經(jīng)兩步反應(yīng)制備帶有氨基活性基團(tuán)的DBP半抗原。所述鄰苯二甲酸二丁酯半抗原制備方法簡(jiǎn)便，穩(wěn)定性好，成本低，容易工業(yè)化生產(chǎn)；鄰苯二甲酸二丁酯半抗原通過(guò)戊二醛法或重氮化法或碳二亞胺法與載體蛋白偶聯(lián)制備鄰苯二甲酸二丁酯人工全抗原，為制備特異性好、效價(jià)高的抗體和建立基于親和素-生物素化放大系統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附分析方法提供了保障。
【IPC分類(lèi)】G01N33/53, C07C229/62, C07K14/765, C07C227/04
【公開(kāi)號(hào)】CN105085298
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510514899
【發(fā)明人】莊惠生, 孫瑞艷
【申請(qǐng)人】上海交通大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年11月25日
【申請(qǐng)日】2015年8月20日