一種酪蛋白磷酸肽單體及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物活性肽技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種以牛乳中酪蛋白為原料得到的酪蛋白磷酸肽(CPP)單體及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]酪蛋白磷酸肽(CPP)是以牛乳酪蛋白為原料，通過生物技術(shù)制得，具有促進(jìn)鈣、鐵、鋅等二價(jià)金屬離子吸收和利用的多肽，可用于各種營養(yǎng)、保健食品。酪蛋白磷酸肽是用胰酶或胰蛋白酶水解的多肽，經(jīng)過精制、純化制成，其核心結(jié)構(gòu)為:-Ser(P) - Ser(P)-Ser(P) - Glu - Glu - (Ser:絲氨酸，Glu:谷氨酸，P:磷酸基)。這一結(jié)構(gòu)中的磷酸絲氨酸殘基(-Ser(P)-)成簇存在，在腸道pH弱堿性環(huán)境下帶負(fù)電荷，可阻止消化酶的進(jìn)一步作用，使酪蛋白磷酸肽不會被進(jìn)一步水解。酪蛋白磷酸肽能在小腸下端PH 7?8環(huán)境下與鈣結(jié)合而抑制磷酸鈣沉淀的形成，使游離鈣保持較高的濃度，促進(jìn)鈣的被動吸收，現(xiàn)已作為功能因子添加到保健品及乳品等食品中。
[0003]中國專利公開的“一種制備酪蛋白磷酸肽的方法”(CN103114118 A)，采用在酪蛋白中加入蛋白酶進(jìn)行酶解反應(yīng)，利用超濾膜分離出酶解產(chǎn)物酪蛋白磷酸肽，產(chǎn)物酪蛋白磷酸肽經(jīng)納濾膜脫鹽處理后獲得。該方法操作簡單，設(shè)備要求低，收率高，產(chǎn)品質(zhì)量好，而且反應(yīng)溫度低，能實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，但其采用單一蛋白酶酶解，酪蛋白磷酸肽得率和含量較低(最高產(chǎn)品含量為16%左右)、產(chǎn)品沒有進(jìn)行脫苦，并且沒有指明特定的酪蛋白磷酸肽成分和結(jié)構(gòu)，也沒有驗(yàn)證最終得到的產(chǎn)品是否具有持鈣活性。
[0004]中國專利公開的“一種高純度酪蛋白磷酸肽制備方法”(CN 103571905 A)涉及一種利用復(fù)合酶酶解乳源性酪蛋白為原料制備高純度酪蛋白磷酸肽混合樣品的方法(酪蛋白磷酸肽的得率多17%，含量多90%)，主要經(jīng)過酶解、分離、純化、脫苦、膜過濾、干燥等工藝生產(chǎn)酪蛋白磷酸肽，但也未對持鈣活性最高的酪蛋白磷酸肽成分進(jìn)行分離及結(jié)構(gòu)鑒定，不能規(guī)范化產(chǎn)品質(zhì)量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種制備具有特定序列的天然高活性酪蛋白磷酸肽CPPU CPP2、CPP3，高效液相色譜面積歸一法得純度大于98%，其分子量分別為1224.12、1082.14、1578.70，CPPl 的序列為 SIGpSpSpSEEpSAEVATEEV，屬于 a s2 酪蛋白 68-84 的片段(a S2 (68-84) ) ；CPP2 的序列為 IGpSEpSTEDQAMEDIK，屬于 α SI 酪蛋白 59-73 的片段(a si (59-73) ) ；CPP3 序列為 ELEELNVPGEIVEpSpSpSEESIT，屬于 β 酪蛋白 17-39 的片段(β (17-39))。本發(fā)明所制備的高活性酪蛋白磷酸肽，持鈣活性高，能有效地促進(jìn)體內(nèi)二價(jià)離子的吸收，具有巨大的實(shí)用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)效益。
[0006]本發(fā)明還提供了一種制備上述高活性酪蛋白磷酸肽的方法，該方法利用胰蛋白酶水解酪蛋白，利用調(diào)等電點(diǎn)、醇沉離心、反相硅膠純化、干燥等工藝，得到酪蛋白磷酸肽的多肽單體。能應(yīng)用于以酪蛋白磷酸肽為活性成分的酪蛋白磷酸肽產(chǎn)品的質(zhì)量控制，也為酪蛋白酶解得到的酪蛋白磷酸肽產(chǎn)品提供質(zhì)量控制依據(jù)。
[0007]為解決上述問題，本發(fā)明所提供的酪蛋白磷酸肽單體的制備方法，包括以下步驟:
(1)將酪蛋白加水溶解，再加入胰蛋白酶酶解，滅酶殺菌；
(2)調(diào)節(jié)pH值4.0-5.0，過濾，將濾液調(diào)節(jié)pH值4.0-5.0，過0.2 μ m精濾進(jìn)一再將精濾液調(diào)節(jié)PH值6.0-6.8，過納濾膜，再過反滲透膜；
(3)將步驟(2)所得濃縮液調(diào)節(jié)pH值5.0-6.0，溫度5-10°C，再加入乙醇，調(diào)節(jié)乙醇濃度至40-60%，靜置4-6 h，離心或過濾，收集沉淀；
(4)將步驟(3)所得沉淀用水溶解后過葡聚糖凝膠柱，收集洗脫液，凍干；粉末溶解過中壓柱層析柱，收集洗脫峰，凍干；粉末用水溶解，調(diào)節(jié)PH至5.0 - 6.0，再加入乙醇，調(diào)節(jié)乙醇濃度至50%-70%，離心取沉淀；
(5)將步驟(4)所得沉淀用制備高效液相色譜儀反相硅膠純化，收集酪蛋白磷酸肽洗脫峰，真空濃縮，冷凍干燥，得到純化的酪蛋白磷酸肽。
[0008](6)將步驟(5)所得純化的酪蛋白磷酸肽用高效液相色譜儀進(jìn)行反相硅膠純化，收集酪蛋白磷酸肽洗脫峰，真空濃縮，冷凍干燥，得到酪蛋白磷酸肽單體。
[0009]優(yōu)化的是，步驟(I)中，溶解時(shí)料水重量比為1:4-6，溶解溫度40 °C -50 °C。酶解條件為:加酶量為酪蛋白質(zhì)量的0.1%-0.2%，反應(yīng)溫度40°C -50°C，反應(yīng)時(shí)間I h -2 h，pH
7.0_9.0 ο
[0010]進(jìn)一步優(yōu)化的是，步驟(I)中，酶解條件為:加酶量為酪蛋白質(zhì)量的0.15%，反應(yīng)溫度 45°C，反應(yīng)時(shí)間 1.5 h，pH 8.0ο
[0011 ] 作為優(yōu)化，步驟(3)中，濃縮液調(diào)節(jié)pH值5.5，溫度8°C和乙醇濃度50%，靜置5 h。
[0012]作為優(yōu)化，步驟(5)中，所述反相硅膠純化條件為:HPLC系統(tǒng):LC-8A島津制備高效液相色譜儀；色譜柱:服一 0121 ;色譜條件:流速:10 mL/min ;檢測波長:215 nm ;進(jìn)樣量:1mL ;流動相:A栗超純水(含0.1% (v/v) TFA)，B栗乙腈(含0.1% (v/v) TFA)，B栗初始濃度為 5% ;洗脫方式:二元梯度洗脫；洗脫梯度:0.01 min~25 min，5%~18% ；25.01 min~85 min，18-30% ；85.01 min~95 min, 30°/cr-70% ；95.01 min~120 min, 70%~70%, 120.01 min~150 min,70°/『5%，重復(fù)進(jìn)樣，收集酪蛋白磷酸肽洗脫峰。
[0013]作為優(yōu)化，步驟(6)中，所述反相硅膠純化條件為:HPLC系統(tǒng):LC-15C島津高效液相色譜儀；色譜柱:C18，Ultimate? AQ_C18，5 μ m, 4.6X250 mm ;色譜條件:流速:1 mL/min ;檢測波長:215 nm ;進(jìn)樣量:20 μ L ;流動相:Α栗超純水(含0.1% (v/v)TFA)，B栗乙腈(含0.1% (v/v)TFA)，B栗初始濃度為5% ;洗脫方式:二元梯度洗脫；洗脫梯度0~19.5 min,5%~18% ；19.5—55.5 min, 18%~30% ；55.01 min~65 min, 90% ；65.01 min~75 min，5%，重復(fù)進(jìn)樣，收集酪蛋白磷酸肽洗脫峰。
[0014]本發(fā)明在傳統(tǒng)酪蛋白磷酸肽生產(chǎn)技術(shù)的基礎(chǔ)上，以牛乳中酪蛋白為原料，經(jīng)過胰蛋白酶酶解、滅酶、精濾、醇沉、離心、過葡聚糖凝膠柱、中壓柱層析、反相硅膠純化、干燥等工藝制備持鈣活性高、具有特定序列的酪蛋白磷酸肽CPP1、CPP2、CPP3，通過HPLC-MS/ESI測得CPP1、CPP2、CPP3的分子量分別為1224.12、1082.14、1578.70，Edman反應(yīng)測得三個(gè)活性肽的氨基酸序列，結(jié)果顯示，CPPl的序列為SIGpSpSpSEEpSAEVATEEV，屬于a s2酪蛋白68-84 的片段(a s2 (68-84) ) ；CPP2 的序列為 IGpSEpSTEDQAMEDIK，屬于 α SI 酪蛋白 59-73的片段(a si (59-73) ) ；CPP3 序列為 ELEELNVPGEIVEpSpSpSEESIT，屬于 β 酪蛋白 17-39 的片段(β (17-39))，能應(yīng)用于以該特定序列的酪蛋白磷酸肽為活性成分的酪蛋白磷酸肽產(chǎn)品的質(zhì)量控制。本發(fā)明所得產(chǎn)品流動性好，25%酪蛋白磷酸肽的水溶液澄清透明，顏色為純白色粉末；分子量小，有利于人體吸收；磷酸絲氨酸殘基多，持鈣活性高。
【附圖說明】
[0015]本發(fā)明的上述或附加的方面和優(yōu)點(diǎn)，從結(jié)合下面附圖對實(shí)施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中:
圖1高純度酪蛋白磷酸肽高效液相色譜圖；
圖2制備液相分離酪蛋白磷酸肽的HPLC圖譜；
圖3酪蛋白磷酸肽CPPl單體色譜圖；
圖4酪蛋白磷酸肽CPP2單體色譜圖；
圖5酪蛋白磷酸肽CPP3單體色譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0016]列出本發(fā)明的實(shí)施例，以詳細(xì)說明本發(fā)明。
[0017]實(shí)施例1:一種酪蛋白磷酸肽的制備，包括以下步驟:
(I)向燒杯中加純水4000 mL，開攪拌200 rpm，向燒杯中緩慢投入酪蛋白I kg，在40°C條件下攪拌溶解。加入胰蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解條件為:加酶量為酪蛋白質(zhì)量的0.1%，反應(yīng)溫度40°C，反應(yīng)時(shí)間I h，pH 7.0。將溫度調(diào)節(jié)至80°C，保溫30 min，進(jìn)行滅酶滅菌。
[0018](2)調(diào)節(jié)pH值4.0，過濾除去大分子蛋白。濾液調(diào)節(jié)pH值5.0，過0.2 μπι規(guī)格的精濾裝置，進(jìn)一步除去大分子物質(zhì)。精濾液調(diào)節(jié)PH值6.0，過300 Da納濾膜，除去一些小分子及鹽類，再過反滲透膜濃縮，得到濃縮液。
[0019](3)濃縮液調(diào)節(jié)pH值5.0，溫度5°C，再加入乙醇，調(diào)節(jié)乙醇濃度至40%，靜置6 h，離心或過濾，收集沉淀。
[0020](4)沉淀用水溶解后過G25葡聚糖凝膠柱，用水洗脫，分別收集洗脫液前50 mL, 50-100 mL, 100 - 200 mL，濃縮后凍干。粉末溶解過QuikS印-100中壓柱層析柱系統(tǒng)，中壓柱自裝，中壓洗脫條件:流速20 mL/min ;檢測波長:215 nm ;進(jìn)樣量:5 mL ;流動相:A栗超純水(含0.1% (v/v) TFA), B栗乙腈(含0.1% (v/v) TFA), B栗初始濃度為10% ;洗脫方式:二元梯度洗脫；洗脫梯度:0.01 min?35 min, 10.20% ；35.01 min~125 min, 20-27% ；125.01min~140 min,27%~90% ；140.01 min~155 min,90%~90%,155.01 min~165 min，90%~10%。重復(fù)進(jìn)樣，收集酪蛋白磷酸肽洗脫峰，收集洗脫峰后真空濃縮除去有機(jī)溶劑，冷凍干燥，得到初步純化的酪蛋白磷酸肽。粉末用水溶解，調(diào)節(jié)PH至5.0，再加入乙醇，調(diào)節(jié)乙醇濃度50%，離心取沉淀。
[0021](5)反相硅膠純化。沉淀溶解再進(jìn)行反相硅膠純化，HPLC系統(tǒng):LC-8A島津制備高效液相色譜儀；色譜柱:服一 0121 ;色譜條件:流速10 mL/min ;檢測波長:215 nm ;進(jìn)樣量:I mL ;流動相:A栗超純水(含0.1% (v/v)TFA)，B栗乙腈(含0.1% (v/v)TFA)，B栗初始濃度為5% ;洗脫方式:二元梯度洗脫；洗脫梯度:0.01 min?25 min，5%~18% ；25.01 min?85 min,18?30% ;85.01 min?95 min，309ir^70% ;95.01 min?120 min，70%~70%，120.01 min?150 min，70°/『5%。重復(fù)進(jìn)樣，收集酪蛋白磷酸肽洗脫峰。收集洗脫峰后真空濃縮除去有機(jī)溶劑，冷凍干燥，得到純化的酪蛋白磷酸肽。
[0022](6)再次反相硅膠純化。HPLC系統(tǒng):LC_15C島津高效液相色譜儀；色譜柱:C18，Ultimate? AQ_C18，5 μ m，4.6 X 250 mm;色譜條件:流速:1 mL/min ;檢測波長:215 nm ；進(jìn)樣量:20 μ L ;流動相:Α栗超純水(含0.1% (v/v) TFA), B栗乙腈(含0.1% (v/v) TFA),B栗初始濃度為10% ;洗脫方式:二元梯度洗脫；洗脫梯度0~15 min, 10%~20% ； 15-50 min,20%~27% ；50.01 min?60 min,90% ；60.01 min?70 min，10%。重復(fù)進(jìn)樣，收集酪蛋白磷酸肽洗脫峰。收集酪蛋白磷酸肽洗脫峰后真空濃縮，除去有機(jī)溶劑，冷凍干燥，得到酪蛋白磷酸肽單體。
[0023]實(shí)施例2:—種高純度酪蛋白磷酸肽的制備，包括以下步驟:
(I)向燒杯中加純水5000 mL，開攪拌200 rpm，向燒杯中緩慢投入酪蛋白I kg，在45°C條件下攪拌溶解。加入胰蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解條件為:加酶量為酪蛋白質(zhì)量的0.15%，反應(yīng)溫度45°C，反應(yīng)時(shí)間1.5 h，pH 8.0。將溫度調(diào)節(jié)至85°C，保溫25 min，進(jìn)行滅酶滅菌。
[0024](2)調(diào)節(jié)pH值4.6，過濾除去大分子蛋白。濾液調(diào)節(jié)pH值4.0，過0.2 μ